Кинетические параметры
Страница 3

- это установка порога таким образом, чтобы превышение порогового уровня над базовым уровнем (threshold над baseline) было достаточно малым, но уже статистически достоверным. Обычно выбирают значения в диапазоне 8-10 стандартных отклонений. Недостатком такого метода является то, что поскольку стандартное отклонение - это усредненная величина по всей кинетической кривой, в каких-то конкретных случаях порог может оказаться слишком низким (когда реакция еще не "устаканилась") или, наоборот, слишком высоким (когда уже наблюдаются какие-то отклонения). Этих недостатков лишен следующий метод выбора порога - по второй производной кинетической кривой

. В таком случае, из всех скачков уровня флуоресценции за пороговый уровень выбирается наиболее резкий скачок - абсолютный максимум второй производной. Этот способ наименее чувствителен к способу выбора базовой линии и различиям условий реакции (по материалам www.molbiol.ru).

Анализ кривой плавления

. Оценку качества реакции проводят по специфичности амплификации, определяемой из кривой плавления (для SYBR Green).Кривая должна быть построена в диапазоне температур от температуры отжига (при более низких температурах это делать не имеет смысла) до температуры полной денатурации - примерно 95OC. Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Рис. 6

. Пример кривой плавления [7].

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления [11]. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

В идеальном случае, в реакциях с матрицей мы должны наблюдать один пик (соответствующий плавлению специфического продукта), а контроль "праймеры без ДНК" - слабые, затухающие стохастические колебания во всем диапазоне температур.

Обработка данных.

Методы обработки данных real-time PCR основаны на применении уравнения (3).Основной принцип обработки данных Real-time PCR – это - метод калибровочного графика.

Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия PCR (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям PCR экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами:

а) сдержание примесей в стандартном препарате должно быть сходно с таковым в экспериментальном препарате;

б) для амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК должна быть близка к таковой в экспериментальной ДНК;

Страницы: 1 2 3 4


Методы приготовления препаратов микроорганизмов. Техника взятия культуры для приготовления препарата
Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бакте ...

Первичная идентификация бактерий
В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбу­дителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на раз­личных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхно ...

Метод определения парциального давления углекислого газа в капиллярной крови пловцов
Парциальное давление углекислого газа в крови определяли с помощью потенциометрических микроэлектродов [26]. ...