Кинетические параметры
Страница 3

- это установка порога таким образом, чтобы превышение порогового уровня над базовым уровнем (threshold над baseline) было достаточно малым, но уже статистически достоверным. Обычно выбирают значения в диапазоне 8-10 стандартных отклонений. Недостатком такого метода является то, что поскольку стандартное отклонение - это усредненная величина по всей кинетической кривой, в каких-то конкретных случаях порог может оказаться слишком низким (когда реакция еще не "устаканилась") или, наоборот, слишком высоким (когда уже наблюдаются какие-то отклонения). Этих недостатков лишен следующий метод выбора порога - по второй производной кинетической кривой

. В таком случае, из всех скачков уровня флуоресценции за пороговый уровень выбирается наиболее резкий скачок - абсолютный максимум второй производной. Этот способ наименее чувствителен к способу выбора базовой линии и различиям условий реакции (по материалам www.molbiol.ru).

Анализ кривой плавления

. Оценку качества реакции проводят по специфичности амплификации, определяемой из кривой плавления (для SYBR Green).Кривая должна быть построена в диапазоне температур от температуры отжига (при более низких температурах это делать не имеет смысла) до температуры полной денатурации - примерно 95OC. Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Рис. 6

. Пример кривой плавления [7].

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления [11]. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

В идеальном случае, в реакциях с матрицей мы должны наблюдать один пик (соответствующий плавлению специфического продукта), а контроль "праймеры без ДНК" - слабые, затухающие стохастические колебания во всем диапазоне температур.

Обработка данных.

Методы обработки данных real-time PCR основаны на применении уравнения (3).Основной принцип обработки данных Real-time PCR – это - метод калибровочного графика.

Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия PCR (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям PCR экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами:

а) сдержание примесей в стандартном препарате должно быть сходно с таковым в экспериментальном препарате;

б) для амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК должна быть близка к таковой в экспериментальной ДНК;

Страницы: 1 2 3 4


Безопасность при чрезвычайных ситуациях
Чрезвычайная ситуация. Классификация ЧС: Чрезвычайная ситуация (ЧС) – это нарушение нормальных условий жизнедеятельности людей на определенной территории, вызванное аварией, катастрофой, стихийным или экологическим бедствием, а также массовым инфекционным заболеванием, которые могут приводить к людским или материальным потерям (Сивков ...

Общие принципы хроматографии, классификация хроматографических методов
Всем хроматографическим методам присущи некоторые общие характеристики, позволяющие ниже изложить элементы их обобщенной теории. Однако сначала рассмотрим специфические особенности различных вариантов хроматографического фракционирования. Это, с одной стороны, позволит за теоретическими рассуждениями все время видеть реальные черты хром ...

Эпистаз. Пример и схема.
Эпистаз – подавление генов из одной пары аллелей доминантного и рецессивного генов из другой пары аллелей. Подавляющий ген – эпистатический или супрессор, или ангибитор; подавляющий ген – гипостатичный. Виды: 1) доминантный – супрессор явл доминантным геном 12:3:1 или 13:3; 2) рецессивный – супрессор – рецессивный ген 9:7 или 9:3:4. А – ...