Кинетические параметрыСтраница 4
в) серия разведений стандартной ДНК должна охватывать весь диапазон возможных концентраций субстрата в экспериментальной ДНК.
Если достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях, когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифицируемого фрагмента в реакционной смеси, имеет смысл при наладке эксперимента приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффективности.
В тех случаях, когда требуется оценить "абсолютное" количество субстрата, выбор стандартов для градуировочного графика представляет собой более сложную задачу, поскольку с одной стороны, необходимо знать точное число. Для определения количества матрицы в RT-PCR предложены следующие варианты стандартов:
1. очищенный RT-PCR-продукт;
2. рекомбинантная ДНК;
3. рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией;
4. синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.
При использовании очищенных препаратов в реакцию всегда необходимо добавлять неспецифические ДНК, чтобы приблизить условия реакции к экспериментальным. Для RT-PCR это могут быть, например, обратные транскрипты бактериальной РНК, polyA-РНК, тРНК или рРНК. Однако насколько бы условия реакции со стандартными образцами не были приближены к экспериментальным, "абсолютное" определение по-прежнему остается расчётом относительно стандарта.
Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Активность ФМСФ-КП определяли флюориметрически [42] с использованием дансил-фен-лей-арг в качестве субстрата.
В контрольные пробы вносили 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl, pH 5,6, 50 мкл препарата фермента и 10 мкл 25 мМ ФМСФ, приготовленного на этаноле. ФМСФ вносили в реакционную смесь после внесения преп ...
Предпосылки создания эволюционной теории Ч. Дарвина
К середине XIX в. был сделан ряд важнейших научных открытий, которые противоречили существовавшим взглядам и способствовали укреплению и дальнейшему развитию эволюции, составив научные предпосылки создания эволюционной теории Ч. Дарвина.
Первая брешь в метафизическом мировоззрении была пробита философом Э.Кантом (1724-1804), который в ...
Структура, номенклатура и биосинтез эйкозаноидов
Хотя субстраты для синтеза эйкозаноидов имеют довольно простую структуру (полистовые жирные кислоты), из них образуется большая и разнообразная группа веществ. Наиболее распространены в организме человека простагландины, которые впервые были выделены из предстательной железы, откуда и получили свое название. Позже было показано, что и д ...