Кинетические параметрыСтраница 1
Кинетическая кривая.
Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.
Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5).
Рис 5
. Пример кинетических кривых RealTime PCR (по материалам www.molbiol.ru).
В ней можно выделить три стадии:
1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
3. Плато (стадию насыщения).
Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:
Pn = P0 * E
n
(1) ( www.molbiol.ru),
где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.
Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:
n
= - (1/log E) * log P0 + log Pn/log E
(2) ( www.molbiol.ru)
Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:
C(T)
= - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E
(3) ( www.molbiol.ru),
т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата (по материалам www.molbiol.ru) Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций [19].
Базовый уровень флуоресценции.
Это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала. Как правило, управляющие программы real-time PCR позволяют задать базовый уровень несколькими способами. Необходимо выбрать такой способ, при котором:
1. Обеспечивается минимальный уровень флуоресценции до появления репортерного сигнала.
2. Начало экспоненциальной фазы детектируется с наибольшей точностью.
В общем случае, базовую линию следует выбирать как среднее значение флуоресценции в достаточно широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е. до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона желательно также избегать и циклы вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдаются скачки флуоресценции.
Для SYBR Green, как правило, хорошо работает расчет базового уровня по среднему значению в диапазоне циклов с 3 по 7 (первые 2 цикла не влючают в диапазон, поскольку на них может наблюдаться более сильная флуоресценция из-за недостаточно стабилизировавшейся реакции).
Более осторожно нужно выбирать базовую линию при TaqMan
амплификации, поскольку к началу PCR в смеси может наблюдаться довольно высокий уровень флуоресценции от "сломанных проб" (в которых произошла диссоциация маркера от тушителя). Если "сломанные пробы" не превалируют, это не представляет большой опасности, и базовая флуоресценция постепенно сходит на нет (обычно к 3-7 циклу). Как уже было сказано выше, в таком случае начальный цикл диапазона нужно выбирать такой, в котором флуоресценция от "сломанных проб" уже достигла минимума
Медицинское и ветеринарное значение. Патогенность
Вид Vibrio cholerae вызывают холеру и другие острые кишечные инфекции. Холера — острая инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением тонкой кишки, нарушением водно-солевого обмена и интоксикацией. Это особо опасная, карантинная инфекция.
V.cholerae образует эндотоксин. Кроме того, он выделяет экзотоксин, состоящий из нескольких фр ...
Материал и методика исследования
Материалом для написания отчета по летней практике послужили сборы в районе Хамар-Дабан реки Харамурин в августе 2006 года. Для анализа было собрано 16 особей черного байкальского хариуса. В дальнейшем будет определен возрастной состав рыб их линейные и весовые показатели. В лабораторных условиях будут вскрыты желудочно-кишечные тракты ...
Меры предотвращения зимних повреждений
Гибель происходит тогда, когда острые грани кристаллов льда рвут клеточные мембраны, из-за чего содержимое клетки перемешивается и она теряет способность к сколько-нибудь нормальному метаболизму. Поэтому очень важно для растений связать воду клеточного сока, ограничив ее возможность к образованию льда и одновременно снизив температуру з ...