BioNow

Кинетическая кривая.

Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5).

Рис 5

. Пример кинетических кривых RealTime PCR (по материалам www.molbiol.ru).

В ней можно выделить три стадии:

1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).

2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).

3. Плато (стадию насыщения).

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:

Pn = P0 * E

n

(1) ( www.molbiol.ru),

где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:

n

= - (1/log E) * log P0 + log Pn/log E

(2) ( www.molbiol.ru)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:

C(T)

= - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E

(3) ( www.molbiol.ru),

т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата (по материалам www.molbiol.ru) Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций [19].

Базовый уровень флуоресценции.

Это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала. Как правило, управляющие программы real-time PCR позволяют задать базовый уровень несколькими способами. Необходимо выбрать такой способ, при котором:

1. Обеспечивается минимальный уровень флуоресценции до появления репортерного сигнала.

2. Начало экспоненциальной фазы детектируется с наибольшей точностью.

В общем случае, базовую линию следует выбирать как среднее значение флуоресценции в достаточно широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е. до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона желательно также избегать и циклы вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдаются скачки флуоресценции.

Для SYBR Green, как правило, хорошо работает расчет базового уровня по среднему значению в диапазоне циклов с 3 по 7 (первые 2 цикла не влючают в диапазон, поскольку на них может наблюдаться более сильная флуоресценция из-за недостаточно стабилизировавшейся реакции).

Более осторожно нужно выбирать базовую линию при TaqMan

амплификации, поскольку к началу PCR в смеси может наблюдаться довольно высокий уровень флуоресценции от "сломанных проб" (в которых произошла диссоциация маркера от тушителя). Если "сломанные пробы" не превалируют, это не представляет большой опасности, и базовая флуоресценция постепенно сходит на нет (обычно к 3-7 циклу). Как уже было сказано выше, в таком случае начальный цикл диапазона нужно выбирать такой, в котором флуоресценция от "сломанных проб" уже достигла минимума

Паращитовидные железы
Паращитовидные железы (glandulae parathyroideae) имеют вид округлых или овальных небольших телец, расположенных на задней поверхности долей щитовидной железы. Размеры каждой железы колеблются: длина — 4 — 8 мм, ширина— 34 мм, толщина — 2 — 3 мм. Число этих телец непостоянно (от 2 до 78), в среднем 4 — по 2 железы позади каждой боковой д ...

Биологические микрочипы
В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими метод ...

Адреноблокаторы
Лекарственные средства, влияющие на функции разных адренорецепторов, имеют в настоящее время широкое применение в различных областях медицины. Адренергические рецепторы, для которых природными, т. е. эндогенными, лигандами являются норадреналин и адреналин, первоначально обозначали в общем виде как адренорецепторы. Однако изучение особ ...