BioNow

Кинетическая кривая.

Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5). https://www.intprod.ru гост проектирование музейного комплекса.

Рис 5

. Пример кинетических кривых RealTime PCR (по материалам www.molbiol.ru).

В ней можно выделить три стадии:

1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).

2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).

3. Плато (стадию насыщения).

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:

Pn = P0 * E

n

(1) ( www.molbiol.ru),

где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:

n

= - (1/log E) * log P0 + log Pn/log E

(2) ( www.molbiol.ru)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:

C(T)

= - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E

(3) ( www.molbiol.ru),

т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата (по материалам www.molbiol.ru) Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций [19].

Базовый уровень флуоресценции.

Это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала. Как правило, управляющие программы real-time PCR позволяют задать базовый уровень несколькими способами. Необходимо выбрать такой способ, при котором:

1. Обеспечивается минимальный уровень флуоресценции до появления репортерного сигнала.

2. Начало экспоненциальной фазы детектируется с наибольшей точностью.

В общем случае, базовую линию следует выбирать как среднее значение флуоресценции в достаточно широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е. до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона желательно также избегать и циклы вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдаются скачки флуоресценции.

Для SYBR Green, как правило, хорошо работает расчет базового уровня по среднему значению в диапазоне циклов с 3 по 7 (первые 2 цикла не влючают в диапазон, поскольку на них может наблюдаться более сильная флуоресценция из-за недостаточно стабилизировавшейся реакции).

Более осторожно нужно выбирать базовую линию при TaqMan

амплификации, поскольку к началу PCR в смеси может наблюдаться довольно высокий уровень флуоресценции от "сломанных проб" (в которых произошла диссоциация маркера от тушителя). Если "сломанные пробы" не превалируют, это не представляет большой опасности, и базовая флуоресценция постепенно сходит на нет (обычно к 3-7 циклу). Как уже было сказано выше, в таком случае начальный цикл диапазона нужно выбирать такой, в котором флуоресценция от "сломанных проб" уже достигла минимума

Генетические продукты.
Согласно недавним оценкам Международной службы по внедрению прикладной биотехнологии в сельском хозяйстве посевные "генетические" площади и производство генных зерновых продуктов с каждым годом увеличиваются на 25-30%. Но до сих пор страны - участницы ЕС не определились с перспективами генетических технологий в сельском хозяй ...

Адренергическая и пептидергическая системы
Адреналин был впервые обнаружен в экстрактах надпочечников в 1895г. В 1901г, был осуществлен синтез кристаллического адреналина. Вскоре адреналин нашел применение в медицине для повышения артериального давления при коллапсе, для сужения кровеносных сосудов при местной анестезии, а затем и для купирования приступов бронхиальной астмы. В ...

Цикл развития ржавчинных грибов
Как пример разнохозяйственного ржавчинника с полным циклом развития обычно описывают один вид пукцинии (Pиcciпia gramiпis), вызывающий линейную ржавчину злаков. Весной развитие гриба начинается на листьях барбариса, где обнаруживаются небольшие гипертрофированные оранжевые участки ткани, пронизанные межклетным мицелием с гаусториями. Ми ...