Кинетические параметрыСтраница 2
.
В некоторых случаях флуоресценция от "сломанных" проб наблюдается и на более поздних стадиях PCR, к 20-25 циклу. Такой эффект нежелателен, поскольку он создает трудности при выборе базовой линии, что может привести к "маскировке" начала экспоненциальной фазы. В таком случае рекомендуется собирать реакцию заранее
и инкубировать ее в холодильнике 1 час или более до добавления ДНК (если реакции инкубируются в темноте и при температуре около +4oC, максимальное время инкубации практически неограничено) [20].
Свидетельствами того, что базовый уровень выбран некорректно, являются:
1. Значительное "провисание" кривой флуоресценции ниже нулевого уровня.
2. Положительное значение флуоресценции в точке перегиба (т.е. начала экспоненциальной фазы).
"Провисание" часто является следствием включения в расчетный диапазон циклов, при которых уже наблюдается начало экспоненциальной фазы или, наоборот, начальная флуоресценция. Однако "провисание" может быть вызвано также и выбором слишком узкого диапазона циклов, так что разброс базовой флуоресценции в нем оказывается существенно меньше, чем в среднем по всем циклам.
Положительное значение флуоресценции в точке перегиба также обычно "исправляется" расширением диапазона циклов. Такой эффект также может наблюдаться, если расчет ведется по минимальным, а не по средним значениям диапазона.
Напомним, что вытекающая из уравнения (1) зависимость, отражаемая уравнением (3) позволяет сравнивать результаты различных экспериментов лишь при условии, что PC(T)= const. Таким образом, уровень пороговой флуоресценции PC(T) должен быть одинаков для всех сравниваемых образцов.
Пороговый уровень флуоресценции.
Репортерная флуоресценция наиболее точно отвечает зависимости 3 в самом начале детекции экспоненциальной фазы. На более поздних этапах вклад стохастических эффектов в кинетику реакции становится все более значительным. Поэтому пороговый уровень флуоресценции выбирают в самом начале экспоненциальной фазы, когда стохастические процессы не столь велик.
Существует три основных способа выбора уровня пороговой флуоресценции:
а) на глаз;
б) по превышению над стандартным отклонением кинетической кривой;
в) по второй производной кинетической кривой.
При выборе "на глаз
" за пороговый уровень выбирают минимальный уровень флуоресценции, который во всех проведенных с данной парой праймеров реакциях соответствует началу экспоненциальной фазы. Хотя пороговый уровень должен быть как можно ниже, при его достижении реакция должна уже "устаканиться" - на первом цикле экспоненциальной фазы погрешность определения репортерной флуоресценции обычно достаточно высока (в том числе и из-за того, что выбор baseline также имеет определенную погрешность). Обычно оптимальными являются пороговые уровни порядка 0.05-0.1 единиц флуоресценции, в зависимости от способа задания базовой линии и от того, как ведет себя реакция. Выбор "на глаз" является наиболее корректным с точки зрения уравнения 3, при условии, что базовая линия выбрана одинаково и измерения проводятся одновременно. Таким образом, с нашей точки зрения, им имеет смысл пользоваться, когда необходимо сравнить данные в одной плашке (или, в крайнем случае, нескольких экспериментов, выполненных с использованием одинаковых реактивов, субстратов, на одной и той же машине с небольшим промежутком времени) - например, при отладке реакции. При сравнении более разнородных данных определение "на глаз" будет некорректным. Принцип двух других методов состоит в том, чтобы стандартизировать выбор порога не по абсолютному значению, а по поведению кривой. Выбор порога по превышению над стандартным отклонением кинетической кривой
Температура
У большинства видов дрожжей минимальная температура роста находится в пределах 0-5°С, а максимальная - 30-40°С. Почти все дрожжи могут расти при комнатной температуре 20-25°С. Базидиомицетовые дрожжи в целом характеризуются более низкими максимальными температурами роста, чем аскомицетовые. Однако из этого правила есть ряд исключений.
...
Биологические микрочипы
В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими метод ...
Семенное размножение рододендронов
Растущие виды размножают семенами, а сортовые только вегетативно − черенкованием, прививками, отводками и делением куста. Это обеспечивает сохранность ценных качеств растений, что не всегда удается при семенном размножении. Однако способы вегетативного размножения достаточно сложны и не всем доступны [1].
Из литературных источник ...