Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробиркахСтраница 1
Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.
ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).
Рис. 17.
Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.
В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).
А 
Б
Рис 18.
Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).
Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
|
Объем смеси (мкл) |
Образцы с матрицей (у.е. флуоресценции) |
Образцы без матрицы (у.е. флуоресценции) |
Приращение сигнала (у.е. флуоресценции) |
Образцы с матрицей (у.е. флуоресценции) |
Образцы без матрицы (у.е. флуоресценции) |
Приращение сигнала (у.е. флуоресценции) |
|
в микропробирках |
в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах | |||||
|
1 |
130,43 |
119,12 |
11,31 |
59,44 |
31,38 |
28,06 |
|
2 |
129,82 |
111,55 |
18,25 |
50,89 |
44,01 |
6,88 |
|
3 |
176,10 |
150,34 |
25,76 |
63,01 |
59,86 |
3,14 |
|
4 |
162,77 |
155,13 |
7,64 |
65,70 |
55,88 |
9,82 |
|
5 |
161,55 |
149,38 |
12,17 |
70,00 |
52,70 |
17,30 |
Методы
приготовления препаратов микроорганизмов. Техника взятия культуры
для приготовления препарата
Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бакте ...
Ценотическая характеристика групп водорослей в 2008
году
При проведении качественной оценки собранного материала было выявлено, что на данном участке реки обитают представители из 4 отделов водорослей (Cyanophyta, Chlorophyta, Bacillariophyta и Euglenophyta),7 классов,14 порядков, 33 семейств,80 родов и 193 видов. Причем первое место по числу видов занимает отдел Chlorophyta (53,8860%). Втора ...
Применение препаратов бактериофагов при лечении урологических заболеваний
Несмотря на многообразие препаратов, предлагаемых для химиотерапии бактериальных заболеваний (свыше 600 наименований, из них более 100 антибиотиков), инфекции мочевых путей до настоящего времени занимают первое место среди всех госпитальных инфекций.
Трудности лечения урологической инфекции обусловлены многими факторами. Внедрение эндо ...