Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробиркахСтраница 1
Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.
ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).
Рис. 17.
Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.
В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).
А 
Б
Рис 18.
Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).
Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
|
Объем смеси (мкл) |
Образцы с матрицей (у.е. флуоресценции) |
Образцы без матрицы (у.е. флуоресценции) |
Приращение сигнала (у.е. флуоресценции) |
Образцы с матрицей (у.е. флуоресценции) |
Образцы без матрицы (у.е. флуоресценции) |
Приращение сигнала (у.е. флуоресценции) |
|
в микропробирках |
в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах | |||||
|
1 |
130,43 |
119,12 |
11,31 |
59,44 |
31,38 |
28,06 |
|
2 |
129,82 |
111,55 |
18,25 |
50,89 |
44,01 |
6,88 |
|
3 |
176,10 |
150,34 |
25,76 |
63,01 |
59,86 |
3,14 |
|
4 |
162,77 |
155,13 |
7,64 |
65,70 |
55,88 |
9,82 |
|
5 |
161,55 |
149,38 |
12,17 |
70,00 |
52,70 |
17,30 |
Автономный механизм апоптоза
При развитии эмбриона различают три категории автономного апоптоза: морфогенетический, гистогенетический и филогенетический.
Морфогенетический апоптоз участвует в разрушении различных тканевых зачатков. Примерами являются:
разрушение клеток в межпальцевых промежутках;
гибель клеток приводит к разрушению избыточного эпителия при слиян ...
Использование углеводов при диетическом питании
Многие диеты основаны на исключении из рациона углеводов и увеличении потребления белков и жиров. Опрос, проведенный министерством сельского хозяйства США показал, что еда с повышенным употреблением углеводов менее калорийна и более питательна. Также было обнаружено, что взрослые люди, употребляющие в пищу много углеводов, как правило, ...
Наследственность и генетические рекомбинации у бактерий
Преимущество микроорганизмов над другими организмами состоит, прежде всего, в высокой скорости размножения, гаплоидности и большой разрешающей способности методов генетического анализа этих организмов. Формирование на питательных средах многомиллиардных популяций бактерии в течение суток позволяет проводить быстрый и точный анализ проис ...