Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках

Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках
Страница 1

Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.

ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).

Рис. 17.

Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.

В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).

А Б

Рис 18.

Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).

Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

Объем смеси

(мкл)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)  

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)  

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

в микропробирках

в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах

1

130,43

119,12

11,31

59,44

31,38

28,06

2

129,82

111,55

18,25

50,89

44,01

6,88

3

176,10

150,34

25,76

63,01

59,86

3,14

4

162,77

155,13

7,64

65,70

55,88

9,82

5

161,55

149,38

12,17

70,00

52,70

17,30

Страницы: 1 2


Основные особенности биологической формы организации материи
К основным особенностям биологической формы организации материи относят: рост, целостность, обмен веществ, подвижность, раздражимость, размножение, приспособляемость. Рост организмов происходит путем увеличения их массы за счет размеров и числа клеток. Развитие представлено индивидуальным (онтогенезом) и историческим (филогенезом) раз ...

Обработка данных
Таблица 1. Показатели роста проростков пшеницы (в см) Вариант опыта Контроль Концентрация 1% Концентрация 10% № п/п Зеленая часть Корень Зеленая часть Корень Зеленая часть Корень 1 3.0 10.8 2.3 9.0 0.4 1.5 2 4.2 11.4 4.8 15.4 2.1 2.4 3 7.0 11.6 ...

Наследование признаков, сцепленных с полом
Признаки, гены которых наход-ся в половых хром-мах, наз-ся сцепленные с полом. В у - хром-ме генов. почти нет, поэтому если говорят, что признак сцеплен с полом, значит ген наход-ся в х - хром-ме. Если ген расположен в у - хром-ме, то это обычно оговаривается. У чел-ка известно около 300 генов, находящ-ся в х - хром-ме и вызывающих насл ...