Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках

Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках
Страница 1

Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.

ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).

Рис. 17.

Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.

В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).

А Б

Рис 18.

Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).

Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

Объем смеси

(мкл)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)  

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)  

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

в микропробирках

в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах

1

130,43

119,12

11,31

59,44

31,38

28,06

2

129,82

111,55

18,25

50,89

44,01

6,88

3

176,10

150,34

25,76

63,01

59,86

3,14

4

162,77

155,13

7,64

65,70

55,88

9,82

5

161,55

149,38

12,17

70,00

52,70

17,30

Страницы: 1 2


Температура
У большинства видов дрожжей минимальная температура роста находится в пределах 0-5°С, а максимальная - 30-40°С. Почти все дрожжи могут расти при комнатной температуре 20-25°С. Базидиомицетовые дрожжи в целом характеризуются более низкими максимальными температурами роста, чем аскомицетовые. Однако из этого правила есть ряд исключений. ...

Идеальная клетка
Начнем с рассмотрения модели идеальной клетки, показанной на рис.1.1. В этой клетке содержатся ионы калия, натрия и хлора, а также крупные анионы. Клетка помещена в раствор, содержащий ионы натрия и калия. Другие ионы, присутствующие в реальных клетках, не играют важной роли в формировании потенциала покоя и потому не рассматриваются в ...

Показатели кислотно-основного равновесия и уровня лактата в крови при физической нагрузке
Динамические наблюдения за показателями КОС крови у спортсменов в условиях покоя отражают особенности их текущего функционального статуса, что дает возможность объективно оценить и контролировать процессы адаптации организма к мышечной деятельности [26]. Изучение особенностей КОС крови экспериментальных животных с разным уровнем их ада ...