Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках

Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках
Страница 1

Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.

ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).

Рис. 17.

Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.

В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).

А Б

Рис 18.

Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).

Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

Объем смеси

(мкл)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)  

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)  

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

в микропробирках

в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах

1

130,43

119,12

11,31

59,44

31,38

28,06

2

129,82

111,55

18,25

50,89

44,01

6,88

3

176,10

150,34

25,76

63,01

59,86

3,14

4

162,77

155,13

7,64

65,70

55,88

9,82

5

161,55

149,38

12,17

70,00

52,70

17,30

Страницы: 1 2


Введение.
Если век XIX по праву вошел в историю мировой цивилизации как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку XX-му, в котором нам счастливилось жить, по всей вероятности, уготовано место Века Биологии, а может быть, и Века Генетики. Действительно, за неполных 100 лет после вторичного открытия законов Г. Менделя генетика прошла триумфа ...

Из чего состоит вкус
Разные вещества могут обладать чистым или смешанным вкусом. Вкус всех чисто горьких веществ воспринимается человеком совершенно одинаково. Так, растворы опия, стрихнина, морфия, хинина могут отличаться один от другого интенсивностью вызванного ими чувства горечи, но не его качеством. Если же уравнять интенсивность ощущения, взяв перечис ...

Профилактическое использование
Фагопрофилактика — специфическая профилактика бактериальных инфекционных болезней в эпидемических очагах путем применения бактериофагов лицам с высоким риском заражения. Убедительно показано, что при появлении в детских садах, яслях, школах дизентерийной инфекции использование препаратов фага предотвращает заболевание детей, имевших ко ...