BioNow

Рестриктирующие эндонуклеазы

Одним из наиболее важных результатов генетического изучения бактерий и их бактериофагов явилось открытие рестриктирующих эндонуклеаз – ферментов, которые узнают специфические короткие нуклеотидные последовательности и разрезают обе цепи двойной спирали ДНК в сайте узнавания или на некотором расстоянии от него. В открытии этих ферментов ключевую роль сыграло наблюдение, сделанное примерно 30 лет назад. Оно состояло в том, что бактериофаг, выращенный в клетках одного штамма, инфицируя клетки других штаммов этого же вида, часто растет очень плохо. Более того, выделенные после такой неэффективной инфекции бактериофаги в свою очередь плохо развиваются в исходных клетках. Этот феномен не связан с генотипом фага и был объяснен тем, что в фаге происходят какие-то модификации, контролируемые хозяином. Было высказано предположение, что некий фаговый компонент, необходимый для репликации, специфическим образом модифицируется в клетках хозяина, так что фаг может завершить репликацию при повторном инфицировании того же штамма. При этом его рост в неродственном штамме ограничивается, поскольку последний не содержит соответствующей системы модификации.

Было доказано, что модифицируемым фаговым компонентом является ДНК, а неспособность фага реплицироваться в неродственном штамме обусловлена деградацией инфицирующей фаговой ДНК. Расщепление ДНК инициируется внесением нескольких разрывов в высокоспецифичных сайтах, после чего происходит полная неспецифическая деградация. Модификацией, защищающей некоторые инфицирующие фаговые ДНК, а также геном клетки от разрывов, является штамм-специфичное метилирование ДНК. С помощью генетических и биохимических исследований установлено, что метилирование ДНК происходит в строго специфических участках. Рестрикция осуществляется эндонуклеазами, которые узнают аналогичные короткие специфические последовательности, лишенные метильных групп. Системы модификации и рестрикции всегда соответствуют друг другу, т.е. метилирование и разрезание происходят в одних и тех же последовательностях ДНК. В каждой системе в качестве мишеней для штамм-специфичных систем рестрикции-модификации используются свои короткие последовательности ДНК. Метилированная ДНК не разрезается по этой последовательности родственной рестриктирующей эндонук-леазой. Аналогично рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только те ДНК, у которых не модифицированы соответствующие сайты рестрикции. Регуляция системы рестрикции и модификации осуществляется с помощью родственных наборов генов, и такие парные системы имеются у многих видов бактерий, бактериофагов и плазмид.

При анализе генетической и физической организации сложных геномов особенно важными оказываются два свойства рестриктирующих эндонук-леаз. Первое связано с огромным диапазоном специ-фичностей, проявляемых в совокупности различными рестриктирующими эндонуклеазами, что позволяет разрезать практически любую ДНК на дискретные фрагменты самыми разными способами. Эти фрагменты можно разделить по размерам с помощью гель-электрофореза. Распределение фрагменов по размерам, получающееся при расщеплении данной эндонуклеазной ДНК в специфических сайтах, является своего рода «отпечатком пальцев», характерным для этой ДНК. Второе свойство эндонуклеаз рестрикции связано со способностью многих из них осуществлять несимметричные разрезы двухцепочечной ДНК, в результате чего образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Это позволяет проводить рекомбинацию ДНК in vitro. Любые два сегмента ДНК со взаимодополняющими концами могут объединиться, в результате чего происходит встраивание фрагментов в фаговую, плазмидную ДНК или другие потенциальные векторы. Такие специфические комбинации «вектор–вставка» можно получить в чистом виде путем молекулярного клонирования и амплификации в соответствующих хозяйских клетках.

Геном человека.
В феврале 2001 года два наиболее авторитетных научных журнала в мире "Nature" и "Science" опубликовали отчеты двух научных групп, расшифровавших геном человека. В журнале "Nature" от 12 февраля 2001 года приведены подробные данные о структуре генома человека, полученные международным консорциумом под руково ...

Рецептивные поля: единицы восприятия формы
Все полученные результаты говорят в поддержку идеи иерархической организации, когда усложнение организации рецептивного поля происходит вследствие конвергенции исходных сигналов на новом уровне. Это не означает, что каждое последующее рецептивное поле, более сложное по организации, образовано только комбинацией информации, полученной на ...

Морфология фагов
Применение современных электронных микроскопов, а также усовершенствование методов приготовления препаратов для электронной микроскопии позволили более детально изучить тонкую структуру фагов. Оказалось, что она весьма разнообразна и у многих фагов более сложна, чем структура вирусов растений и ряда вирусов человека и животных. Иллюс ...