Важные открытия
Страница 2

Рестриктирующие эндонуклеазы

Одним из наиболее важных результатов генетического изучения бактерий и их бактериофагов явилось открытие рестриктирующих эндонуклеаз – ферментов, которые узнают специфические короткие нуклеотидные последовательности и разрезают обе цепи двойной спирали ДНК в сайте узнавания или на некотором расстоянии от него. В открытии этих ферментов ключевую роль сыграло наблюдение, сделанное примерно 30 лет назад. Оно состояло в том, что бактериофаг, выращенный в клетках одного штамма, инфицируя клетки других штаммов этого же вида, часто растет очень плохо. Более того, выделенные после такой неэффективной инфекции бактериофаги в свою очередь плохо развиваются в исходных клетках. Этот феномен не связан с генотипом фага и был объяснен тем, что в фаге происходят какие-то модификации, контролируемые хозяином. Было высказано предположение, что некий фаговый компонент, необходимый для репликации, специфическим образом модифицируется в клетках хозяина, так что фаг может завершить репликацию при повторном инфицировании того же штамма. При этом его рост в неродственном штамме ограничивается, поскольку последний не содержит соответствующей системы модификации.

Было доказано, что модифицируемым фаговым компонентом является ДНК, а неспособность фага реплицироваться в неродственном штамме обусловлена деградацией инфицирующей фаговой ДНК. Расщепление ДНК инициируется внесением нескольких разрывов в высокоспецифичных сайтах, после чего происходит полная неспецифическая деградация. Модификацией, защищающей некоторые инфицирующие фаговые ДНК, а также геном клетки от разрывов, является штамм-специфичное метилирование ДНК. С помощью генетических и биохимических исследований установлено, что метилирование ДНК происходит в строго специфических участках. Рестрикция осуществляется эндонуклеазами, которые узнают аналогичные короткие специфические последовательности, лишенные метильных групп. Системы модификации и рестрикции всегда соответствуют друг другу, т.е. метилирование и разрезание происходят в одних и тех же последовательностях ДНК. В каждой системе в качестве мишеней для штамм-специфичных систем рестрикции-модификации используются свои короткие последовательности ДНК. Метилированная ДНК не разрезается по этой последовательности родственной рестриктирующей эндонук-леазой. Аналогично рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только те ДНК, у которых не модифицированы соответствующие сайты рестрикции. Регуляция системы рестрикции и модификации осуществляется с помощью родственных наборов генов, и такие парные системы имеются у многих видов бактерий, бактериофагов и плазмид.

При анализе генетической и физической организации сложных геномов особенно важными оказываются два свойства рестриктирующих эндонук-леаз. Первое связано с огромным диапазоном специ-фичностей, проявляемых в совокупности различными рестриктирующими эндонуклеазами, что позволяет разрезать практически любую ДНК на дискретные фрагменты самыми разными способами. Эти фрагменты можно разделить по размерам с помощью гель-электрофореза. Распределение фрагменов по размерам, получающееся при расщеплении данной эндонуклеазной ДНК в специфических сайтах, является своего рода «отпечатком пальцев», характерным для этой ДНК. Второе свойство эндонуклеаз рестрикции связано со способностью многих из них осуществлять несимметричные разрезы двухцепочечной ДНК, в результате чего образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Это позволяет проводить рекомбинацию ДНК in vitro. Любые два сегмента ДНК со взаимодополняющими концами могут объединиться, в результате чего происходит встраивание фрагментов в фаговую, плазмидную ДНК или другие потенциальные векторы. Такие специфические комбинации «вектор–вставка» можно получить в чистом виде путем молекулярного клонирования и амплификации в соответствующих хозяйских клетках.

Страницы: 1 2 3


Размножение
Бактериальная клетка начинает делится после завершения последовательных реакций, связанных с воспроизведением ее компонентов. У быстро растущих культур имеется несколько репликационных точек. Процесс репликации ДНК сопровождается сегрегацией синтезирующих цепей ДНК клетки. В разделении нитей ДНК большую роль играют мезосомы клетки. Во ...

Список сокращений
АКТГ – адренокортикотропный гормон АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота АПФ – ангиотензинпревращающий фермент БД-рецепторы – бензодиазепиновые рецепторы ГАМК – γ-аминомасляная кислота ГТ-Рг – гонадотропин-рилизинг гормон ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота ДА-рецептор ...

Методы идентификации нуклеиновых кислот
Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энте ...