BioNow

Как это часто бывает при развитии науки, методологии рекомбинантных ДНК прокладывали путь многие открытия, казавшиеся ранее незначительными и не имеющими отношения к делу. Одним из таких открытий была трансдукция. Другие связаны с выделением и изучением свойств бактериальных плазмид и рестриктирующих эндонуклеаз.

Бактериальные плазмиды

Одним из неожиданных следствий использования антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний было появление устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов. Эта очень важная проблема требовала своего решения и стимулировала интенсивные исследования. Вскоре стало ясно, что устойчивость к лекарственным препаратам представляет собой относительно стабильный генетический признак, который может быть передан чувствительным бактериальным клеткам способом, напоминающим инфекционный процесс. Позже было установлено, что распространение резистентности к антибиотикам происходит при контактировании клеток друг с другом. Было показано, что резистентные к антибиотикам клетки содержат генетические элементы – плазмиды, не связанные с хромосомной ДНК, способные реплицироваться независимо от хромосомы и передаваться от клетки к клетке при их контактировании. Именно такие внехромосомные элементы и содержат гены, которые придают клеткам наследуемую устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Они получили название факторов резистентности, или R‑факторов.

Механизм распространения R‑факторов стал более понятен после того, как был установлен способ переноса генетической информации от одной клетки к другой во время конъюгации бактерий. Перенос генетического материала осуществляется благодаря способности донорных клеток реплицировать и переносить свою геномную ДНК через конъюгационный мостик в клеки реципиента. Штаммы Е. coli, являющиеся донорами, содержат в составе своего генома ДНК плазмидного происхождения, названную фактором фертильности, или F‑фактором. Такие донорные хромосомы образуются после приобретения клетками F‑фактора и рекомбинации между этой плаз-мидой и хромосомой клетки. В присутствии интегрированного F‑фактора облегчаются конъюгация и перенос хромосомы. Перенос инициируется в сайте интеграции F‑фактора. Благодаря способности плазмиды встраиваться в ДНК во многих сайтах разные штаммы инициируют перенос в различных сайтах хромосомы E. coli. В некоторых случаях F‑фактор остается в клетках в виде независимого внехромосомного элемента – F‑плазмиды. Такие клетки, обозначаемые F+, переносят плазмиду F в реципиентные клетки таким же способом, как в случае переноса R‑факторов.

R- и F‑факторы представляют собой ковалентно замкнутые кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК. Оба они содержат гены, обеспечивающие их репликацию в виде автономных плазмид и их перенос при контакте с соответствующими реципиентами. R‑факторы несут также гены резистентности к антибиотикам. Одни такие гены изменяют реакцию клетки на антибиотик, другие индуцируют образование белков, вызывающих деградацию или модификацию определенных антибиотиков. Например, одна из R‑плазмид кодирует в-лактамазу, обеспечивающую устойчивость к ампициллину благодаря деградации этого антибиотика. Устойчивость к хлорамфениколу обусловливается ацетилированием этого антибиотика. Ацетилирование катализируется ферментом хлорамфеникол-ацетилтранс-феразой, кодируемым плазмидой.

Плазмидные ДНК легко выделить в больших количествах и получить в очищенном виде, что позволяет исследовать их потенциальную способность служить векторами для введения в клетки новых сегментов ДНК. Соединение плазмидной ДНК с соответствующим образом модифицированными вставками можно осуществить in vitro аналогично тому, как это происходит в случае соединения вставок с фаговыми векторами. В этих экспериментах большую роль сыграл опыт осуществления трансформации клеток с помощью ДНК. Были разработаны методы включения очищенной плазмидной ДНК в клетки соответствующих бактерий-хозяев. Благодаря наличию в таких плазмидах генов резистентности к антибиотикам можно провести отбор клеток, содержащих R‑плазмиду в качестве стабильно реплицирующейся структуры. Такие клетки живут и делятся в присутствии антибиотика, а клетки, утратившие эту плазмиду, погибают. Рекомбинантные плазмидные ДНК сохраняются в присутствии антибиотика как некие автономно реплицирующиеся геномы во время последующих клеточных делений. При клонировании образуются колонии клеток, содержащих уникальную рекомбинантную ДНК, потому что каждая клетка хозяина содержит только одну плазмиду. Поскольку размер многих плазмидных векторов не превышает нескольких тысяч пар нуклеотидов, обогащение по сегментам эукариотической ДНК в этом случае оказывается более высоким, чем при использовании фаговых векторов. Именно плазмиды оказались первыми векторами, с помощью которых было осуществлено молекулярное клонирование в клетках бактерий.

Система детекции результатов анализа
После амплификации регистрацию флуоресцентного сигнала проводили на экспериментальной установке, собранной на базе бинокулярного микроскопа МБС-11 (Россия ) c телевизионным адаптором TV-A и камерой фирмы «Wateс» (Japan) WAT-120 N. Сигнал с камеры подавался на плату видеозахвата «PixelView CX 881 P», находящийся на шине IDE персонального ...

Строение и функции органоидов клетки
Органоиды – специфические дифференцируемые структуры клетки, выполняющие определённые функции. Э.П.С.состоит из канальцев, узких щелевидных полостей, расширенных полостей, отдельных пузырьков и мешочков. 2 типа Э.П.С.: агранулярная, гранулярная. Агранулярная представлена только мембранным комплексом, она участвует в синтезе углеводов и ...

Размеры и форма колоний
Важные признаки колоний — их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний — признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий. В большинстве случаев ко­лонии грамположительных бактерий мель­че колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнят ...