Метод определения активности карбоксипептидазы Н

Активность КП Н определяли флюорометрическим методом по Supattapone S., Fricker L.D., Snyder S.H. [262].

Для определения активности фермента смешивали 150 мкл (в случае контрольной пробы) или 140 мкл (в случае опытной пробы) вышеуказанного буфера с 50 мкл гомогената ткани. Опытные пробы содержали 1 мкМ ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ дансил-Phe-Ala-Arg на 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,6 (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции – дансил-Phe-Ala – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, несодержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Постнеклассический этап
В современную эпоху происходят новые радикальные изменения в основаниях науки. Эти изменения можно охарактеризовать как четвертую глобальную научную революцию, в ходе которой рождается новая постнеклассическая наука. Интенсивное применение научных знаний практически во всех сферах социальной жизни, изменение самого характера научной де ...

Лизосомные болезни накопления
Концепция лизосомных болезней накопления сложилась в результате изучения гликогеноза II типа (Помпе). Факт накопления гликогена в лизосомах вследствие недостаточности a-глюкозидазы, а также данные, полученные при исследовании других аномалий, позволили Эру определить врожденную лизосомную болезнь как такое состояние, при котором: 1) опр ...

Понятия: мутация, мутагенез, мутант. Классификация мутаций
Мутация – стойкое изменение в ДНК и кариотипе особи. Мутагенез - процесс возникновения мутации. Мутаген – фактор, вызывающий мутацию. Мутант – осыбь, у которой мутация проявилась. Классификация: І. По возможности наследования 1. соматические, возник в кл тела и по наследству не передаётся, но в организме появляется клон мутантных кл ...