ЧИП-методика
Страница 1

Более простая часть задачи получения гена, когда в нашем распоряжении имеется нужная индивидуальная иРНК. Но как ее получить, если мы располагаем только некоторым количеством клеток животного происхождения, в которых синтезировался интересующий нас белок, и, следовательно, имеется соответствующая ему иРНК?

Очевидно начать надо с того, что отделить суммарную фракцию всех иРНК этих клеток от всех прочих РНК. Для этого достаточно закрепить на неподвижной твердой основе в достаточном количестве молекулы все того же олиго дТ и пропустить мимо них раствор всех выделенных РНК клеток. Это делается методом колоночной «аффинной» хроматографии, с которым мы в свое время будем знакомиться подробно. Но и так ясно, что нетрудно создать условия, при которых закрепленные неподвижно олиго дТ «выхватят» из протекающего мимо раствора суммарных РНК все молекулы иРНК путем гибридизации с их поли А «хвостами». Все прочие РНК спокойно протекут мимо. После чего любым достаточно мягким способом (нагреванием или действием слабой щелочи) можно будет разорвать водородные связи поли А — олиго дТ гибридов и получить в растворе суммарную фракцию всех иРНК.

Теперь дело за тем, чтобы из этой суммарной фракции выловить нужную нам индивидуальную иРНК, ответственную за синтез интересующего нас белка. Казалось бы это сделать не так уж сложно.

Мы можем без особого труда с помощью секвенатора белков установить аминокислотную последовательность (хотя бы и неполную) нашего белка. Далее, используя генетический код, установить некую последовательность нуклеотидов (не менее 20-ти), отвечающую определенной последовательности аминокислот (не менее семи) в нашем белке. Синтезировать эту последовательность, как описано выше, опять закрепить на неподвижной основе и пропустить мимо нее суммарный раствор всех иРНК. Благодаря гибридизации с достаточно протяженным участком своего гена (пусть и искусственно синтезированного) мы можем опять выловить теперь уже нашу индивидуальную иРНК. Ошибки тут быть не может. Вероятность того, что в двух разных иРНК окажутся одинаковые последовательности, комплементарные к одному и тому же участку гена длиной в 20 нуклеотидов практически равна нулю.

Как будто все просто, но . вспомним, что генетический код-то вырожденный . Нам неоткуда узнать как в данном конкретном случае была использована эта вырожденность. И это вдруг чрезвычайно усложняет задачу. Верхняя строчка обозначает последовательность из семи аминокислот, которую мы, предположим, выбрали из известной аминокислотной последовательности нашего белка. Выбрали далеко не самый тяжелый случай. Из семи аминокислот только двум отвечает по 4 кодона. Нет ни одной «шестикодонной» аминокислоты и даже фигурирует триптофан, у которого только один кодон. Даже и в этом случае для того, чтобы наверняка «поймать» нужную нам иРНК придется перепробовать все варианты. То есть синтезировать не одну последовательность из 21-го нуклеотида, а все возможные последовательности, исчерпывающие все допустимые комбинации использования разрешенных кодонов. Нетрудно подсчитать число их: 4-2'2'2-4'1-2 = 256.

Итак, надо будет синтезировать 256 21-членных олигонуклеотидов и 256 раз повторить опыты по гибридизации с суммарной фракцией всех иРНК. Это — огромная работа (хотя и пустячная по сравнению с некоторыми другими современными исследованиями, когда приходится ставить тысячи параллельных опытов по гибридизации).

Страницы: 1 2 3


Фосфорилирование рецепторов и десенсибилизация
Физиологический ответ на действие гормона или нейромедиатора обычно является кратковременным даже при постоянном присутствии агониста. Это явление называется десенсибилизацией и характерно для многих систем ответа как у эукариот, так и у прокариот. Десенсибилизация системы хемотаксиса Е. coli частично обусловлена ковалентной модификаци ...

Взаимодействия белков с матричными РНК
Механизм мРНК-белковых узнаваний является, пожалуй, наименее изученным вопросом в проблеме РНК-белковых взаимодействий, в виду отсутствия структур, решённых с достаточно высоким разрешением (исключение - комплекс L30-мРНК). Однако, опираясь на данные полученные методом ядерного магнитного резонанса было сделано предположение, что основ ...

Перечислите важнейшие различия между эукаритическими и прокариотическими клетками
Характеристика Прокариоты Эукариоты Размеры клеток Диаметр в среднем 0,5-5 мкм Диаметр обычно до 40 мкм Объем клетки в 103-105 раз больше, чем объем клетки эукариот. Форма Одноклеточные и нитчатые Одноклеточные, нитчатые или многоклеточные. Генетический материал Кольцевая ДНК в цитоплазме, нет мате ...