ЧИП-методика
Страница 1

Более простая часть задачи получения гена, когда в нашем распоряжении имеется нужная индивидуальная иРНК. Но как ее получить, если мы располагаем только некоторым количеством клеток животного происхождения, в которых синтезировался интересующий нас белок, и, следовательно, имеется соответствующая ему иРНК?

Очевидно начать надо с того, что отделить суммарную фракцию всех иРНК этих клеток от всех прочих РНК. Для этого достаточно закрепить на неподвижной твердой основе в достаточном количестве молекулы все того же олиго дТ и пропустить мимо них раствор всех выделенных РНК клеток. Это делается методом колоночной «аффинной» хроматографии, с которым мы в свое время будем знакомиться подробно. Но и так ясно, что нетрудно создать условия, при которых закрепленные неподвижно олиго дТ «выхватят» из протекающего мимо раствора суммарных РНК все молекулы иРНК путем гибридизации с их поли А «хвостами». Все прочие РНК спокойно протекут мимо. После чего любым достаточно мягким способом (нагреванием или действием слабой щелочи) можно будет разорвать водородные связи поли А — олиго дТ гибридов и получить в растворе суммарную фракцию всех иРНК.

Теперь дело за тем, чтобы из этой суммарной фракции выловить нужную нам индивидуальную иРНК, ответственную за синтез интересующего нас белка. Казалось бы это сделать не так уж сложно.

Мы можем без особого труда с помощью секвенатора белков установить аминокислотную последовательность (хотя бы и неполную) нашего белка. Далее, используя генетический код, установить некую последовательность нуклеотидов (не менее 20-ти), отвечающую определенной последовательности аминокислот (не менее семи) в нашем белке. Синтезировать эту последовательность, как описано выше, опять закрепить на неподвижной основе и пропустить мимо нее суммарный раствор всех иРНК. Благодаря гибридизации с достаточно протяженным участком своего гена (пусть и искусственно синтезированного) мы можем опять выловить теперь уже нашу индивидуальную иРНК. Ошибки тут быть не может. Вероятность того, что в двух разных иРНК окажутся одинаковые последовательности, комплементарные к одному и тому же участку гена длиной в 20 нуклеотидов практически равна нулю.

Как будто все просто, но . вспомним, что генетический код-то вырожденный . Нам неоткуда узнать как в данном конкретном случае была использована эта вырожденность. И это вдруг чрезвычайно усложняет задачу. Верхняя строчка обозначает последовательность из семи аминокислот, которую мы, предположим, выбрали из известной аминокислотной последовательности нашего белка. Выбрали далеко не самый тяжелый случай. Из семи аминокислот только двум отвечает по 4 кодона. Нет ни одной «шестикодонной» аминокислоты и даже фигурирует триптофан, у которого только один кодон. Даже и в этом случае для того, чтобы наверняка «поймать» нужную нам иРНК придется перепробовать все варианты. То есть синтезировать не одну последовательность из 21-го нуклеотида, а все возможные последовательности, исчерпывающие все допустимые комбинации использования разрешенных кодонов. Нетрудно подсчитать число их: 4-2'2'2-4'1-2 = 256.

Итак, надо будет синтезировать 256 21-членных олигонуклеотидов и 256 раз повторить опыты по гибридизации с суммарной фракцией всех иРНК. Это — огромная работа (хотя и пустячная по сравнению с некоторыми другими современными исследованиями, когда приходится ставить тысячи параллельных опытов по гибридизации).

Страницы: 1 2 3


Структура хроматина. Полиморфизм ДНК
В живых организмах молекулы ДНК представляют собой либо очень длинные, либо замкнутые в кольцо двуспиральные молекулы, поэтому любой процесс, связанный с передачей наследственной информации, должен наталкиваться на серьезные топологические проблемы: возникновение положительной (+) или отрицательной (-) сверхспирализации ДНК, образование ...

Методы исследования. Метод введения половых стероидных гормонов
При изучении влияния половых гормонов на КП Н и ФМСФ-ингибируемую карбоксипептидазу in vivo все препараты вводились внутрибрюшинно в виде растворов в оливковом масле. Вводимый объем был равен 0,1 мл. Дозы половых гормонов были следующими: 1) 3 и 30 мг на кг массы в случае пропионата тестостерона; 2) 1 и 10 мг на кг массы в случае прогес ...

Гомеостаз
Этот термин впервые был применен американским физиологом Кэнноном, который писал: "Координированные физиологические процессы, которые поддерживают большую часть устойчивых состояний в организме, так сложны и настолько специфичны для живых существ, поскольку могут включать совместную работу головного мозга и нервов, сердца, легких, ...