BioNow

Фермент проявляет максимальную активность при рН 5,6-6,0, что соответствует рН внутри секреторных гранул [137, 148, 149, 247]. КП Н сильно активируется ионами Со2+ (в 5 – 10 раз) и в меньшей степени – ионами Ni2+ (в 2 – 3 раза), полностью ингибируется ионами Cu2+, Cd2+ и ЭДТА. Ионы других двухвалентных металлов (Zn2+, Ca2+, Mg2+) не влияют на его активность [147, 148, 149]. Ионы Zn2+ полностью восстанавливают активность КП Н после ингибирования его действия 1 мМ раствором ЭДТА, при добавлении ионов Со2+ и Ni2+ активность фермента значительно повышалась, а Ca2+ и Mg2+ активность фермента не восстанавливали [15]. Ионы Ca2+ влияют на агрегацию и высвобождение белка из секреторных везикул [161, 242, 305]. Таким образом, карбоксипептидаза Н – это металлозависимый фермент, в активном центре которого находится ион Zn2+ [15]. Реагенты на сульфгидрильные группы HgCl2 и N-этилмалеимид существенно ингибируют активность фермента [144]. 2-меркаптоэтанол, каптоприл и ФМСФ не оказывают заметного влияния на активность КП Н [15, 220]. Карбоксипептидаза Н содержит SH-группу(ы) и является тиолзависимым цинк-металлоферментом [15]. Активность КП Н ингибируется CuCl2, HgCl2, р-хлормеркурфенилсульфатом, АПМЯК, ЭДТА, 1,10-фенантролином и 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой [123, 149, 175, 181]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Ki 8,8 и 7,5, соответственно [114, 144, 280, 311]. Активность фермента существенно снижается при добавлении рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, вещества Р, тиреотропин-рилизинг фактора, вазопрессина, окситоцина, Met- и Leu-энкефалина, АКТГ [180, 259, 282].

КП Н обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми основными аминокислотами [26, 27, 123, 326]. КП Н хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от природных и синтетических субстратов. 125I-Met-энкефалин-Arg6, 125I-Met-энкефалин-Lys6 [19], АКТГ-Lys15-Lys16-Arg17, Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg являются природными субстратами исследуемого фермента [175, 181, 282]. Для определения активности КП Н разработано множество методов, наиболее часто используемым является флюорометрический метод Friker и Snyder с использованием таких субстратов как дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Аrg [144, 149, 311]. О-кумароил-Phe-Ala-Arg [45], даларгин [47], Leu5-энкефалин [47], [3Н]-бензоил-Phe-Leu-Arg, [3Н]-бензоил-Phe-Ala-Arg [278, 308], 125I-acetyl-Tyr-Ala-Arg, гиппурил-Arg [143] и другие также были предложены в качестве субстратов для определения активности КП Н.

У мышей линии fat/fat единичная точечная мутация Ser202 на Pro в гене, кодирующем КП Н, приводит к нарушению созревания регуляторных пептидов: инсулина [186], холецистокинина [203], пронейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона [102, 283], тириолибирина [246], проэнкефалина [139], а также изменяет деятельность опиоидных рецепторов [88, 139]. Кроме того, нарушается внутриклеточный транспорт гормонов гипофиза через конститутативный путь [246, 293]. Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие [110, 216, 307].

Следует отметить, что внешнее воздействие способно быстро изменять уровень мРНК КП Н. Увеличение концентрации мРНК КП Н в гипоталамусе наблюдается при увеличении содержания окситоцина и вазопрессина [86], в ганглионарных клетках сетчатки глаза уровень мРНК КП Н повышается сразу после смены условий освещенности [288].

В клетках GH4C1 (из переднего гипофиза крысы, продуцирующих пролактин) 50 мМ раствор KCl увеличивает секрецию КП Н и пролактина в 10 раз, а 100 мМ тиреотропин-рилизинг фактор – в 2 – 3 раза [145]. Кроме того, эстрадиол (1 нМ), инсулин (300 нМ) и фактор роста эпидермиса (10 нМ) увеличивают внутриклеточный уровень КП Н в 2 раза по сравнению с контролем. Km при этом не изменяется, но увеличивается Vmax [145].

Rodriguez и соавт. обнаружили, что действие дексаметазона на клетки AtT-20 снижает уровень мРНК КП Н и ПОМК примерно на 30% [277]. С другой стороны, прибавление кортикотропин-рилизинг фактора к клеткам, которые подвергались воздействию дексаметазона, вызывает 2 – 3-х кратное увеличение уровня мРНК КП Н и ПОМК [277]. Авторы считают, что уровни мРНК ПОМК и КП Н согласованно регулируются кортикотропин-рилизинг фактором и стероидными гормонами. При действии кортикотропин-рилизинг фактора на клетки AtT-20, не подверженные действию дексаметазона, происходит возрастание активности КП Н [223].

Расселение, экология и демография Homo sapiens.
К тому времени, когда окончательно сформировался человек современного типа, освоены были уже огромные географические пространства Земли. Они были заселены еще архантропами и палеоантропами, так что кроманьонцу осталось освоить лишь два пустующих материка – Америку и Австралию. Правда, в отношении Австралии вопрос остается открытым. Не и ...

Сборка нуклеосом
1 способ. обусловлен способностью тетрамера Н32Н42 организовывать ДНК в частицы, которые несколько напоминают минимальную нуклеосому (по их чувствительности к нуклеазе микрококков). При добавлении димера Н2А • Н2В эти тельца могут превращаться в минимальную нуклеосому. Именно отсюда возникла идея о том, что в структуре нуклеосомы сущест ...

Окрашивание препарата по способу Грама
1. Метил-виолет 30 сек. 2. Краску слить самотеком. 3. Высушить мазок фильтровальной бумагой. 4. Налить на 30сек. раствор люголя. 5. Слить самотеком раствор люголя. 6. Обесцвечивать спиртом 15 сек. 7. Промыть препарат водой. 8. Дополнительная окраска - разведенный фуксин 1 мин. 9. Промыть препарат водой, высушить фильтровальной б ...