Материалы » Принципы биохимических исследований » Разрушение клеток и экстракция. Центрифугирование

Разрушение клеток и экстракция. Центрифугирование
Страница 1

Принцип метода, основные определения и формулы. Центрифугирование применяется для разделения неоднородных жидких сред.

Центрифугирование позволяет разделить смесь, состоящую из двух или более компонентов с разной удельной плотностью, если по крайней мере один из этих компонентов - жидкость.

Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.

Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (, в рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (г, в см): G = 2 • г. Поскольку один оборот ротора составляет 2л радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту (об. /мин) можно записать так: v = 2p60 (об. /мин), а центробежное ускорение тогда будет равно: G =4p2r/3600 (об. /мин) 2.

Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g {гравитационная постоянная, равная 980 см*с-1) и называется относительным центробежным, ускорением (ОЦУ), т.е. ОЦУ=4p2r/3600*980 (об. /мин) 2 или ОЦУ = 1,11*10-5*r (об. /мин) 2 (*)

На основании уравнения (*) Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г - среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке (т.е. расстояния от оси вращения до середины столбика жидкости).

Номограмма для расчета центробежного ускорения

0000-68.jpg

Для определения G соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах; точка пересечения этой прямой со средней шкалой дает искомую величину центробежного ускорения. Следует иметь в виду, что правая колонка цифр шкалы G соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора; левая - левой.

Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением (закон Стокса, видоизмененный Сведбергом и Никольсом):

0000-67.jpg

где t - время седиментации, с; h - вязкость среды, Паскаль • секунда; гч - радиус частицы, см; рч - плотность частицы (удельный вес); p - плотность среды (жидкости) или удельный вес; гм - расстояние от оси вращения до мениска жидкости, см; гд - расстояние от оси вращения до дна пробирки, см.

Как следует из уравнения (**), при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно выделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды.

Описанными методами можно выделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы (или другие микротельца), микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети) и, наконец, рибосомы.

Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению (**), поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании конформации макромолекул.

Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований.

С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов.

Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.

Страницы: 1 2


Выделение грибов.
Культуральные условия и потребности роста у патогенных грибов отличаются от таковых у возбудителей бактериальных инфекций. Большинство патогенных грибов не требовательно к питательным средам и хорошо растёт в аэробных условиях. Для роста грибов среды могут включать какой-либо органический источник углерода, неорганического азота в виде ...

Понятие биологического возраста
Понятие биологического возраста возникло в результате осознания неравномерности развития, зрелости и старения. Одна из важнейших закономерностей онтогенеза − это неравномерность возрастных изменений. Это явление служит причиной расхождения между хронологическим и биологическим возрастом организма. Возраст — продолжительность пери ...

Введение новой генетической информации в клетки бактерий
Бактерии могут приобретать новый генетический материал несколькими способами. Это: 1) трансформация, при которой в клетки проникают молекулы ДНК, добавленные в культуральную среду; 2) конъюгация, в процессе которой ДНК непосредственно переносится от одной клетки к другой; 3) опосредуемая бактериофагами трансдукция, при которой новая г ...