Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации

ПЦР ставили по протоколам с использованием SYBRgreen и TaqMan. Амплификация проходила в микропланшетах в объеме смеси – 1 мкл (на геле эти образцы обозначены прописной буквой «ч») и как контроль в амплификаторе «ТерЦик» под минеральным маслом в объеме 20 мкл(на геле – это образцы с индексом «а»). Заглавные буквы T и S означают ПЦР с системой TaqMan и SYBRgreen соответственно. Индексы 1, 2 и 3 в системе TaqMan означают использование разных растворов полимераз и в принципе важного значения для этого опыта не имеют, поэтому их можно расценивать как 3 повтора. Индекс «чдо» у одного из S означает ПЦР-смесь до амплификации. В карман геля наносили по 5 мкл образца. М – маркер – смесь нуклеиновых кислот размером от 50 до 1000 п.н.

На рис. видно, что амплификация прошла во всех пробах системы TaqMan. Шесть полос, проявившихся на геле чуть ниже уровня полосы маркера с цифрой 100 означают, что во всех этих пробах прошла реакция и наработался фрагмент ДНК размером около 100 п.н. На дорожках, куда вносили пробы после амплификации в «Терцике» полосы проявились сильнее, чем на дорожках с пробами из чипа. Значит наработанного фрагмента в плашках меньше, чем в макрообъеме под маслом. Это обстоятельство опять же объясняется форматом микрообъемов, где погрешности каждого из этапов работы становится критичным. В случае с SYBRgreen также наблюдается подобная картина. Полоски не проявились в случае с образцом не прошедшим амплификацию и проявились на дорожках лунок, куда вносили образцы после амплификации. Следовательно амплификация в них прошла и наработался фрагмент размером около 600 п.н.

Гель фотографировали с зеленым светофильтром, пропускающим соответствующую длину волны красителя (520 нм). На геле хорошо заметны зеленые полосы крашенной наработанной в процессе амплификации ДНК и исходной матрицы(полосы в самом начале карманов), которая имеет большой размер (5000 п.н.) и за время разделения успела только войти в гель. Опять же количество наработанного фрагмента в чипе меньше (хоть и не значительно по сравнению с системой TaqMan), чем в макрообъемной ПЦР-смеси. Однако нужно обратить внимание на то, что верхняя полоса в лунке S18ч окрашена слабее, чем в лунке S18а. Это говорит о том, что изначально количество матрицы в образце было меньше, что опять же связано с погрешностями в работе с микрообъемами.


Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных ани­зотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганиз­мов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поля­ризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях. ...

Экологические проблемы современности.
Человечество слишком медленно подходит к пониманию масштабов опасности, которую создает легкомысленное отношение к окружающей среде. Между тем решение (если оно еще возможно) таких грозных глобальных проблем, как экологические, требует неотложных энергичных совместных усилий международных организаций, государств, регионов, общественност ...

Генетическая устойчивость к бесплодию
Бесплодие – нарушение воспроизводства потомства. Обусловлено многими факторами среды и генами. Во многих стадах гл причиной выбраковки – бесплодие. Степень проявления воспроизводительной способности варьирует от нормальной плодовитости до абсолютного бесплодия. Методами борьбы с бесплодием явл оценка генотипов производителей и интенсивн ...