Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)
В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl2. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94оС), а при комнатной оставался неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н.
Постановка ПЦР:
· 7 нг матрицы,
· 0,2 мкМ pc1,
· 0,2 мкМ pc2,
· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл,
· 2 мкл SYBRgreen,
· 2 мкл буфера (сток х 10),
· 2 мкл 2мМ MgCl2,
· 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл),
· 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты).
Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке.
Температурный режим (1 цикл):
|
94о С 120 сек |
1 цикл |
|
94о 20 сек |
30 циклов |
|
60о 20 сек | |
|
72 о С 40 сек | |
|
и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек | |
Этапы и периоды онтогенеза
Онтогенез
(греч. on, ontos — сущее, существо; genesis — происхождение, развитие) — процесс индивидуального развития, рассматривается как совокупность последовательных морфологических, физиологических, психофизиологических и биохимических преобразований организма в течение всего жизненного цикла от момента оплодотворения яйцеклетки и об ...
Участок обитания маньчжурского зайца.
Размеры индивидуального участка маньчжурского зайца, на котором он держится постоянно, в поперечнике не превышает и нескольких сотен метров. Поэтому при повышенной их плотности от интенсивного выборочного поедания претерпевает существенные изменения. Заметнее это проявляется на ограниченных локальных площадях, например, на островных лес ...
Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях
эстрального цикла
а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс
В гипофизе, надпочечниках и гонадах активность фермента была ниже чувствительности метода определения, поэтому в случае карбоксипептидазы M исследование проводили только в гипоталамусе и стриатуме. В гипоталамусе и стриатуме не обнаружено зависимости активности КПМ от ...