Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl2. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94оС), а при комнатной оставался неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2 мкМ pc1,

· 0,2 мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл,

· 2 мкл SYBRgreen,

· 2 мкл буфера (сток х 10),

· 2 мкл 2мМ MgCl2,

· 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл),

· 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке.

Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


Механизмы действия эйкозаноидов
Один и тот же тип эйкозаноида может действовать по паракринному и по аутокринному механизму. Например, ТХА2, продуцируемый тромбоцитами при их активации, действует на сами тромбоциты, увеличивая их способность к агрегации, и в то же время действует на окружающие ГМК кровеносных сосудов, способствуя их сокращению. Таким образом создаются ...

Источники азота
Универсальным источником азота для дрожжей являются соли аммония. Многие дрожжи способны усваивать азот в окисленной форме – в виде солей нитратов и нитритов. Дрожжи, использующие нитраты, имеют две ферментные системы: первая восстанавливает нитрат до нитрита, вторая – нитрат до аммония. У некоторых видов присутствует только вторая фер ...

Образование лизосом
По морфологии выделяют 4 типа лизосом: 1. Первичные лизосомы 2. Вторичные лизосомы 3. Аутофагосомы 4. Остаточные тельца Первичные лизосомы представляют собой мелкие мембранные пузырьки, заполненные бесструктурным веществом, содержащим набор гидролаз. Маркерным ферментом для лизосом является кислая фосфотаза. Первичные лизосомы наст ...