Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)
В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl2. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94оС), а при комнатной оставался неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н.
Постановка ПЦР:
· 7 нг матрицы,
· 0,2 мкМ pc1,
· 0,2 мкМ pc2,
· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл,
· 2 мкл SYBRgreen,
· 2 мкл буфера (сток х 10),
· 2 мкл 2мМ MgCl2,
· 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл),
· 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты).
Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке.
Температурный режим (1 цикл):
|
94о С 120 сек |
1 цикл |
|
94о 20 сек |
30 циклов |
|
60о 20 сек | |
|
72 о С 40 сек | |
|
и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек | |
Методы снятия промеров с печени.
Длина печени измеряется от вентрального края до места впадения каудальной полой вены. Ширина печени измеряется в самом широком месте. Толщина печени измеряется в самом толстом месте. Масса печени измеряется на электронных весах. Методы снятия промеров с почек.
Длина почек измеряется, от краниального до каудального края
Ширина почек из ...
Практическое использование фагов
Первыми были выделены фаги, активные против патогенных микроорганизмов (дизентерийной палочки). Вполне естественно, что у исследователей многих стран возник вопрос об использовании фагов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями (дизентерия, брюшной тиф, паратифы, холера и др.). Многочисленные исследован ...
Грибы-двойники.
Очень многие ядовитые и даже смертельно ядовитые грибы похожи на свои ценные съедобные двойники. В одних случаях это сходство сравнительно поверхностное, в других – сильное. Такие грибы называются грибами-двойниками. Их может спутать не только неопытный, но и грибник со стажем, что приводит нередко к роковым ошибкам. В связи с этим охар ...