Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl2. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94оС), а при комнатной оставался неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2 мкМ pc1,

· 0,2 мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл,

· 2 мкл SYBRgreen,

· 2 мкл буфера (сток х 10),

· 2 мкл 2мМ MgCl2,

· 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл),

· 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке.

Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


Растения, каких жизненных форм растут естественно или культивируются в районе вашего места жительства или работы? Назовите по два-три вида растения каждой жизненной формы
Фанерофиты – Тополь, Омела; Хамефиты – Брусника, Черника; Гемикриптофиты - Одуванчик, Лютик; Геофиты – Ветреница, Тюльпан; Терофиты – Мак самосейка (По Раункиеру). ...

Общая характеристика работы
Для успешного выращивания рододендрона в культуре и правильного его использования необходимо знать закономерности роста этого растения, сроки заложения и формирования у него почек, особенности цветения и плодоношения, отношение рододендрона к экстремальным условиям среды и многие другие вопросы биологии, которые, к сожалению, до сих пор ...

Баланс элементов питания почве
Баланс питательных веществ может быть биологическим и хозяйственным. Биологический баланс питательных веществ осуществляется бактериями: азотфиксирующими, фиксирующими серу и другими. Также существуют бактерии и микроорганизмы способствующие разрушению питательных веществ почвы. Хозяйственный баланс включает в себя вынос питательных ве ...