Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen)

В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl2. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94оС), а при комнатной оставался неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2 мкМ pc1,

· 0,2 мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл,

· 2 мкл SYBRgreen,

· 2 мкл буфера (сток х 10),

· 2 мкл 2мМ MgCl2,

· 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл),

· 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке.

Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


Дихотомический путь
Это основной путь распада органических веществ для всех живых организмов. Выделяют 2 этапа дихотомического пути: гликолиз и цикл Кребса. Рис. 1 Основные этапы дыхания ...

Запах
Запах — менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий — молочной сыворотки, протеев — гнилостный запах, нокардий — свежевскопанной земли. ...

Биосфера и космос. Человек и космос.
Биосфера и космос – это два различных мегауровня организации универсума, между которыми существует тесное единство. Став относительно самостоятельной силой, биосфера сама определяет геологический лик Земли, в частности она способствовала обогащению атмосферы кислородом. Биосфера реагирует также на космические воздействия. Ближайшими к ...