Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Определение спектра поглощения и эмисии SYBRgreen

Определение спектра поглощения и эмисии SYBRgreen

В RealTimeПЦР используют как описано выше несколько видов зондов. В своих исследованиях мы использовали SYBR Green. При выборе зондов мы руководствовались несколькими параметрами, в том числе стоимость, совместимость с системой детекции и т.д. Технологии Molecular beacons и LightCycler стоят ощутимо дорого, и их осмысленно применять лишь в том случае, когда требуется крайне специфичная детекция лишь одного из образующихся PCR-продуктов (например, при анализе SNP). Методики SYBR Green и TaqMan стоят дешевле, однако каждый из них имеет свои особенности. В таблице 1, приведенной ниже, сравниваются методики SYBR Green и TaqMan. В наших исследованиях мы использовали эти системы. Они активно используются в RealTimeПЦР для определения количественных параметров ПЦР непосредственно в ходе реакции. Однако мы для решения поставленных задач пользовались этими методиками для детекции сигнала по конечной точке.

В своей работе мы использовали флуоресцентный интеркалирующий краситель SYBRgreen (10000 кратный сток производства фирмы «ДНК-синтез») и набор компонентов для проведения ПЦР с использованием TaqMan, синтезированных компанией «Синтол» (наработанный продукт амплификации имеет размер около 100 п.н.).

Краситель SYBR Green - исключительно чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Применяется для realtime-PCR, а также для прокраски гелей (как агарозных, так и полиакриламидных). Предел обнаружения двухцепочечной ДНК для SYBR Green составляет 1-2 нанограмма для коротких синтетических олигонуклеотидов и до 20 пикограмм высокомолекулярной природной ДНК. SYBR Green I обладает существенно высокой специфичностью в отношении ДНК-дуплекса и является более безопасным по сравнению с другими красителями – он не оказывает высокого уровня мутагенного действия.

Методика

Достоинства

Недостатки

SYBR Green

Значительно дешевле собрать новую реакцию, т.к. достаточно лишь заказать новые праймеры.

Невозможность работать больше, чем с одной PCR-реакцией в одной реакционной смеси. Высокие требования к специфичности реакции - любая двуцепочечная ДНК, в том числе димеры праймеров, будет генерировать репортерную флуоресценцию. Меньшая точность при малых количествах субстрата.

Окисление со временем

TaqMan

Возможность проведения нескольких количествленных реакций в одной смеси. Меньшие требования к специфичности реакции: репортерная флуоресценция будет генерироваться только при гибридизации пробы со специфическим PCR-продуктом. Бóльшая точность при малых количествах субстрата.

Дороговизна. Новый зонд (около $200) для каждой реакции. Меньше возможностей для оптимизации (если реакция не пошла с данной комбинацией зонда и праймеров, то, скорее всего, придется заказывать новый зонд и новые праймеры).

Данные о флуоресценции: максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК). Обычно SYBR Green хорошо работает примерно до C(T) = 35-37, затем точность начинает падать. Диапазон достоверности результатов легко проверить для каждой конкретной пары праймеров, проведя несколько независимых real-time PCR.

В системе TaqMan использовали зонд, меченный красителем FAM и имеющий следующую последовательность:

5’(FAM) – СTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG – (TAMRA) – 3’. Длина 33 нуклеотида. Молекулярный вес 10137. Длина волны возбуждения FAM 470 нм, длина волны эмиссии 525 нм.

Перед работой определяли спектр поглощения и испускания света интеркалятора на приборе Perkin Elmer MPF-44-B Fluorescence Spectrophotometer. Результаты измерений представлены на рис. 13.

Рис. 13.

График зависимости сигнала фотодетектора от длины волны.

На рисунке синей кривой показан спектр поглощения света красителем. Кривая получена при эмисии образца 520нм. Видно что SYBR поглощает свет длинной 260нм (первый пик). Второй пик приходится на 470 и 495 нм. Зеленая кривая показывает спектр испускания длины волны. Согласно ей, интеркалятор испускает свет с длиной волны 520 нм. Эта кривая получена при возбуждении образца длинной волны 470 нм.


Газообмен в легких и тканях
Кровь, поступающая в легкие по системе малого круга кровообращения, содержит мало кислорода и много углекислого газа. Обмен газов между кровью и воздухом, поступающим в легкие, осуществляется путем их диффузии через тонкие стенки легочных пузырьков и кровеносных сосудов: кислород из воздуха переходит в кровь, а углекислый газ из крови — ...

Компоненты пищи, неблагоприятно влияющие на организм
В продуктах и напитках могут содержаться природные токсические соединения - лектины, небелковые аминокислоты, гликозиды и др. Лектины - это гликопротеины, обладающие местным и общим токсическим действием. Они нарушают всасывание в тонком кишечнике, повышают проницаемость стенок кишечника, поэтому вызывают проникновение чужеродных веще ...

Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan.
На одну пробу объемом 20 мкл смешивают: · 8,75 мкл смеси А, · 8,75 мкл смеси Б, · 0,2 мкл Taq-полимеразы, · 2 мкл ДНК. 95о С 5 мин 1 цикл 95о С 20 сек 40 циклов 62о С 20 сек 72 о С 40 сек и по окончании нужного количества циклов 72 о С 40 сек ...