Виды RealTime ПЦР

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы.

Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).

Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (Рис. 1) В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения [13]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение[19].

Рис. 1

. Схема ПЦР в реальном времени с использованием зонда TaqMan.[7]

С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемой модели позволяла обнаруживать 0,28 нг (приблизительно 20 копий ) ДНК в пробе[8]


Биологические методы
Выделение патогенных бактерий от заражённых животных имеет большую диагностическую ценность, особенно при контрольном применении иммунных сывороток. Цель подобных мани­пуляций — уменьшение времени проведения бактериологических исследований. • При диагностике инфекций, вызванных эффектами токсина (например, ботулизма или сибирской язвы) ...

Наличие собственной программы развития системы и способность к активному оперированию информацией
Всем живым системам любого уровня сложности, как организменным„ так и надорганизменным, совершенно независимо от их функционально-структурных особенностей, элементарной основы и всех других качеств, свойственно наличие определенной собственной программы развития, реализация которой обеспечивает сохранение системы в меняющихся условиях в ...

Роль эйкозаноидов в тромбообразовании
Свёртывание крови можно рассматривать как процесс, который поддерживается в состоянии равновесия противодействующими системами: свёртывания и противосвёртывания. В условиях патологии или при действии фармакологических средств это равновесие может смещаться в ту или другую сторону. В норме клетки эндотелия сосудов продуцируют простацикли ...