Виды RealTime ПЦР

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы.

Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).

Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (Рис. 1) В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения [13]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение[19].

Рис. 1

. Схема ПЦР в реальном времени с использованием зонда TaqMan.[7]

С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемой модели позволяла обнаруживать 0,28 нг (приблизительно 20 копий ) ДНК в пробе[8]


Из истории естествознания
Первой в истории человечества наукой была философия. Она являлась вместилищем всех человеческих знаний об окружающем мире, а наука о природе была ее составной частью и называлась натурфилософией, т.е. философией природы. Натурфилософия стала первой формой существования естествознания. Первое понимание природы содержало много вымышленно ...

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в 8% ПААГ
Для приготовления геля было использовано. gels 1 2 H2O (мл) 3,7 7,4 30%АА/bAA (29:1) (мл) 1,87 3,74 5х ТВЕ (мл) 1,4 2,8 TEMED (мкл) 20 40 10% PSA (мкл) 27 54 Собирали кассету с вертикальными пластинками. В гель вносили полимеризаторы, перемешивали и заливали 4.2 мл меж ...

Биология прорастания семян и развития проростков. Материал исследования
В качестве объектов исследования были выбраны представители рода Рододендрон, интродуцированные семенами из репродукции Центрального ботанического сада НАН Беларуси, которые в дальнейшем были высеяны и за которыми ведётся наблюдение. Систематический список объектов исследования приведён в таблице 1. Для решения поставленных целей и зада ...