Виды RealTime ПЦР
Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы.
Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (Рис. 1) В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения [13]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение[19].
Рис. 1
. Схема ПЦР в реальном времени с использованием зонда TaqMan.[7]
С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемой модели позволяла обнаруживать 0,28 нг (приблизительно 20 копий ) ДНК в пробе[8]
Идентификация вирусов
Качественное определение
Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т.д.), куриных эмбрионах и на клетках (в культурах). Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, ре ...
Материалы и методы исследования. Материалы
исследования
Опыты проводили на самках и самцах белых беспородных крыс массой 150-200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария.
В работе использовали четыре группы животных. У самок крыс определяли стадию эстрального цикла по влагалищному мазку [59], при цитологическом исследовании которого животных разделяли на три группы. Животные пер ...
Приложения
Приложение 1.
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА (вариант 1)
Время культивирования, сутки
рН
Биомасса, г/л
ЭДТА, г/л
Аммоний, г/л
0
7,35
0,025
0,873
0
1
8,13
0,026
0,734
7,0
2
8,52
0,072
0,526
8,0
3
9,21
0,183
0
9,9
4
9,64
0,179
0
1 ...