BioNow

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы.

Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).

Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (Рис. 1) В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения [13]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение[19].

Рис. 1

. Схема ПЦР в реальном времени с использованием зонда TaqMan.[7]

С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемой модели позволяла обнаруживать 0,28 нг (приблизительно 20 копий ) ДНК в пробе[8]

Расчет баланса гумуса и питательных веществ в почве севооборота. Баланс гумуса в почве севооборота
Гумус является основным органическим веществом почвы (85-90%), 10-15% представлены негумифицированными остатками растительного, микробного и животного происхождения. Образование и накопление гумуса в почве происходит за счет разложения органических остатков. В почвах ОАО "Надежда" содержание гумуса составляет 3,2%. Таблица 11 ...

Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (Fluorescent resonance energy transfer - FRET).
Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов [11] (Рис 3). Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму ...

Собственные исследования. Материал и методы исследований
Для исследования белки обыкновенной были изъяты из охотничьего фонда Свободненского района пять особей. Две особи мужского пола были изъяты в весенне-летний период, три особи, одна из которых самка, в осенне-зимний период. Для установления биологических и морфологических особенностей белки обыкновенной были использованы методы визуальн ...