Связывание на фильтрах

Является стандартно используемой методикой для определения РНК-белковых взаимодействий и оценки константы связывания. Принцип данного метода основан на способности нитроцеллюлозных фильтров удерживать белки, а также связанные РНК, пока несвязанные РНК проходят через фильтр. Несмотря на свою концептуальную простоту, метод всё же не является достаточно надёжным и не подходит для изучения некоторых РНК-белковых комплексов: он хорошо работает для сравнительно небольших молекул РНК, большие же молекулы РНК-белковых комплексов часто не удерживаются.

Методика заключается в том, что эквимолярные количества радиоактивной РНК смешиваются с белком в различной концентрации и фильтруются через нитроцеллюлозные фильтры. В идеале при высокой концентрации белка должно удерживаться до 100% РНК, в действительности же этот процент значительно меньше. Кроме того, белковые фракции также могут не удерживаться фильтром. Например, при анализе взаимодействия белка L18 с 5S рРНК было обнаружено, что эффективность связывания комплекса 5SрРНК-L18 составляла 35% при удержании 65% белка L18, и < 5% для свободной 5S рРНК. Тем не менее, точность измерения не зависит непосредственно от эффективности задерживания.

На оценку эффективности связывания влияют многие параметры, и они должны быть оптимизированы для каждого конкретного случая:

Буфер

: Повышение концентрации солей уменьшает эффективность связывания. Для большинства комплексов концентрация одновалентных ионов должна составлять около 150 mM, чтобы гарантировать специфичность связываться.

Температура

: Низкая температура увеличивает эффективность связывания.

Скорость подачи буфера и условия промывки

: скорость подачи буфера должна быть постоянной (одной и той же) в каждом эксперименте. Неспецифическое удержание несвязанного РНК на фильтре можно уменьшать интенсивной промывкой, но зачастую это ведёт и к снижению специфической сорбции в целом. Поэтому для некоторых комплексов применяется промывка небольшим объёмом, в то время как для других комплексов наилучшие результаты получаются при промывке большими объёмами.

Ренатурация РНК

: хорошо известно, что разные препараты РНК дают различную эффективность связывания. Тщательная ренатурация уменьшает вариабельность между этими препаратами [23].


Стратегия роющей осы
Самцы большой золотой роющей осы откладывают яйца в подземные норки, куда они перед этим закладывают длиннорогих кузнечиков, служащих пищей для личинок. Джейн Брокман тщательно изучила поведение самок этих ос. Она почти непрерывно проводила записи гнездовой активности 68 индивидуально покрашенных самок на трех различных участках на прот ...

Трансплантация и клонирование эмбрионов млекопитающих
Трансплантация —метод ускоренного воспроизводства высоко продуктивных животных путем получения и переноса одного или нескольких эмбрионов от высокоценных животных (доноров) менее ценным животным (реципиентам). Использование трансплантации позволяет получать от одной генетически ценной самки в десятки раз больше потомства. Приемы: 1) гор ...

Гортань
Гортань (larynx) располагается в передней области шеи на уровне IV—VI шейных позвонков, ниже подъязычной кости, образуя здесь заметное возвышение. У мужчин оно особенно хорошо выражено («адамово яблоко»). При разговоре, пении, кашле гортань смещается, следуя за подъязычной костью, с которой соединена. У детей гортань расположена выше (н ...