Связывание на фильтрах
Является стандартно используемой методикой для определения РНК-белковых взаимодействий и оценки константы связывания. Принцип данного метода основан на способности нитроцеллюлозных фильтров удерживать белки, а также связанные РНК, пока несвязанные РНК проходят через фильтр. Несмотря на свою концептуальную простоту, метод всё же не является достаточно надёжным и не подходит для изучения некоторых РНК-белковых комплексов: он хорошо работает для сравнительно небольших молекул РНК, большие же молекулы РНК-белковых комплексов часто не удерживаются. www.banksession.ru
Методика заключается в том, что эквимолярные количества радиоактивной РНК смешиваются с белком в различной концентрации и фильтруются через нитроцеллюлозные фильтры. В идеале при высокой концентрации белка должно удерживаться до 100% РНК, в действительности же этот процент значительно меньше. Кроме того, белковые фракции также могут не удерживаться фильтром. Например, при анализе взаимодействия белка L18 с 5S рРНК было обнаружено, что эффективность связывания комплекса 5SрРНК-L18 составляла 35% при удержании 65% белка L18, и < 5% для свободной 5S рРНК. Тем не менее, точность измерения не зависит непосредственно от эффективности задерживания.
На оценку эффективности связывания влияют многие параметры, и они должны быть оптимизированы для каждого конкретного случая:
Буфер
: Повышение концентрации солей уменьшает эффективность связывания. Для большинства комплексов концентрация одновалентных ионов должна составлять около 150 mM, чтобы гарантировать специфичность связываться.
Температура
: Низкая температура увеличивает эффективность связывания.
Скорость подачи буфера и условия промывки
: скорость подачи буфера должна быть постоянной (одной и той же) в каждом эксперименте. Неспецифическое удержание несвязанного РНК на фильтре можно уменьшать интенсивной промывкой, но зачастую это ведёт и к снижению специфической сорбции в целом. Поэтому для некоторых комплексов применяется промывка небольшим объёмом, в то время как для других комплексов наилучшие результаты получаются при промывке большими объёмами.
Ренатурация РНК
: хорошо известно, что разные препараты РНК дают различную эффективность связывания. Тщательная ренатурация уменьшает вариабельность между этими препаратами [23].
Определение активности карбоксипептидазы Н
50мкл 1% гомогената смешивали со 150мкл 50мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5.6, в случае контрольной пробы; в случае опытной пробы 50мкл 1% гомогената смешивали со 140мкл 50мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5.6 с добавлением 10мкл ГЭМЯК.
Смесь инкубировали 8 мин при 37°C. Реакцию начинали прибавлением 50мкл субстрата (DNS-фен-лей-арг, при ...
Выводы:
1. Получен и обработан набор дифракционных данных для комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).
2. Методом молекулярного замещения определена структура комплекса.
3. Показано, что рибосомный белок комплекса S15 связывается с 16S рРНК в двух пространственно удалённых участках.
4. Показано, что мутация Т3С не изменяет пространственной ст ...
Основные понятия «элементарность», «простое-сложное», «деление».
Утверждение «система состоит из элементов»
всегда означало, что эта система представляет собой объект, состоящий из частей, меньших по величине или по массе, но сохраняющих внутри этой системы определенную индивидуальность, самостоятельность (конечно, ограниченную взаимодействием этих частей в рамках включающей их большей системы ...