Связывание на фильтрах
Является стандартно используемой методикой для определения РНК-белковых взаимодействий и оценки константы связывания. Принцип данного метода основан на способности нитроцеллюлозных фильтров удерживать белки, а также связанные РНК, пока несвязанные РНК проходят через фильтр. Несмотря на свою концептуальную простоту, метод всё же не является достаточно надёжным и не подходит для изучения некоторых РНК-белковых комплексов: он хорошо работает для сравнительно небольших молекул РНК, большие же молекулы РНК-белковых комплексов часто не удерживаются.
Методика заключается в том, что эквимолярные количества радиоактивной РНК смешиваются с белком в различной концентрации и фильтруются через нитроцеллюлозные фильтры. В идеале при высокой концентрации белка должно удерживаться до 100% РНК, в действительности же этот процент значительно меньше. Кроме того, белковые фракции также могут не удерживаться фильтром. Например, при анализе взаимодействия белка L18 с 5S рРНК было обнаружено, что эффективность связывания комплекса 5SрРНК-L18 составляла 35% при удержании 65% белка L18, и < 5% для свободной 5S рРНК. Тем не менее, точность измерения не зависит непосредственно от эффективности задерживания.
На оценку эффективности связывания влияют многие параметры, и они должны быть оптимизированы для каждого конкретного случая:
Буфер
: Повышение концентрации солей уменьшает эффективность связывания. Для большинства комплексов концентрация одновалентных ионов должна составлять около 150 mM, чтобы гарантировать специфичность связываться.
Температура
: Низкая температура увеличивает эффективность связывания.
Скорость подачи буфера и условия промывки
: скорость подачи буфера должна быть постоянной (одной и той же) в каждом эксперименте. Неспецифическое удержание несвязанного РНК на фильтре можно уменьшать интенсивной промывкой, но зачастую это ведёт и к снижению специфической сорбции в целом. Поэтому для некоторых комплексов применяется промывка небольшим объёмом, в то время как для других комплексов наилучшие результаты получаются при промывке большими объёмами.
Ренатурация РНК
: хорошо известно, что разные препараты РНК дают различную эффективность связывания. Тщательная ренатурация уменьшает вариабельность между этими препаратами [23].
Схема пищеварительного тракта человека
Система органов пищеварения состоит из ротовой полости с тремя парами крупных слюнных желез, глотки, пищевода, желудка, тонкой кишки, в состав которой входит двенадцатиперстная, тощая и подвздошная кишки, и толстой кишки, состоящей из слепой, ободочной и прямой кишок (рис.).
В ротовой полости начинается физическая и химическая обработк ...
Морфологические проявления апоптоза
Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотным ...
ДНК — двунитевые полимеры (у человека)
Не менее значительные успехи были достигнуты и в понимании механизма наследственности. Еще в 40-х годах господствовало мнение, что ее обеспечивают специальные белки. Затем было убедительно показано, что за сохранение и передачу потомству всех признаков вида (а также индивидуальных особенностей родителей, если процесс размножения двуполы ...