Материалы » Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла » Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Антигенные особенности
V.cholerae имеет соматический термостабильный О-антиген и жгутиковый термолабильный H-антиген. О-Аг. По структуре О-Аг выделяют 139 серогрупп. Возбудитель холеры относится к серогруппам 01 и 0139 (его обозначение V.cholerae 01 или V.cholerae 0139), другие представители вида V.cholerae не являются возбудителями холеры, но могут вызывать ...

История химии, алхимия. История алхимии
Алхимия складывалась в эпоху эллинизма на основе слияния прикладной химии египтян с греческой натурфилософией, мистикой и астрологией (золото соотносили с Солнцем, серебро – с Луной, медь – с Венерой, и т.д.) (II-VI вв.) в александрийской культурной традиции, представляя собой форму ритуально-магического (герметического) искусства. Алхи ...

Характеристика штамма LPM-4
Штамм LPM-4 был выделен в лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН к.б.н. Чистяковой Т. И. из активного ила Пущинских очистных сооружений методом накопительной культуры [6]. Клетки неподвижны, колонии на твердой питательной среде с ЭДТА через неделю роста 0,1-0,3 см в диаметре, круглые, перламутровые с синеватым блеском. Аэроб, н ...