Материалы » Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла » Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Представления о времени и пространстве в классической механике в теории относительности. Принцип относительности в классической механике.
Впервые этот принцип был установлен Галилеем, но окончательную формулировку получил лишь в механике Ньютона. Для его понимания нам потребуется ввести понятие системы отсчета, или координат. Как известно, положение движущегося тела в каждый момент времени определяется по отношению к некоторому другому телу, которое называется системой от ...

Семейство злаковые (Poaceae, Gramineae).
Злаки играют выдаю­щуюся роль в жизни человека и занимают господствующее положение при формировании ряда типов тра­вянистой растительности — лугов, степей, прерий и пампасов, а также саванн. Известны примерно 900 ро­дов и до 11 000 видов злаков. В стра­нах СНГ естественно произрастает и культивируется свыше 1500 видов злаков, относящихс ...

Влияние генов и среды на развитие признака
Примером влияния гена на общий метаболизм явл действие доминантного гена коротконогости у кур, который в гомозиготном состоянии летален, т.к.вызывает общие нарушения развития и гибель зародыша через 76 часов после начала инкубации. Примером влияния генов на отдельные биохимические реакции явл финилаланинтиразиновый обмен у человека. Исх ...