Материалы » Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла » Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Теория относительности Эйнштейна
В 1905 году Эйнштейн в работе «К электродинамике движущих сред» сформулировал два предположения, которые в современной науке именуются постулатами теории относительности». 1. Принцип относительности: все законы природы одинаковы во всех инерциальных системах отчета; 2. Принцип постоянства скорости света: скорость света в пустоте одина ...

Почему они сами сомневаются?
В качестве одного из козырных вопросов "зеленых" является такой: "А вы можете нам гарантировать, что трансгенные организмы будут всегда абсолютно безопасны?" Любой нормальный ученый скажет, что, конечно, трансгенные организмы безвредны и можно гарантиро­вать их безопасность, но предвидеть абсолютно все невозможно. &q ...

Дыхание
При росте в аэробных условиях при низком содержании глюкозы в среде дрожжи получают АТФ за счет процессов дыхания, как это делает большинство аэробных организмов. Полное окисление субстрата до углекислого газа и воды может происходить у дрожжей с помощью трех различных механизмов: в цикле трикарбоновых кислот, в глиоксилатном цикле и в ...