Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М
Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].
Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.
Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.
Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Материалы и методы. Условия культивирования
Штамм LPM-4 стерильно пересевали на скошенные косяки ЭДТА-содержащего агара и выдерживали в термостате 5 суток. Для получения инокулята осуществляли смыв культуры с косяков, засевали в жидкую среду с ЭДТА и культивировали 3-4 суток. После чего инокулят в количестве 10 мл переносили в стерильные 750-мл колбы с 200 мл стерильной жидкой ср ...
Поможет ли маркировка?
В кампанию по борьбе с трансгенными продуктами включились и общества защиты потребителей. Их главное требование заключается в том, чтобы потребитель мог делать "осознанный" выбор. Без сомнения, потребитель должен иметь выбор. Но будет ли он в данных условиях "осознанным"? Сейчас, по требованию ЕС пищевые продукты, ...
Принцип положительной обратной связи
Неравномерность и неустойчивость, возникающая в открытой системе, вследствие взаимодействия системы со средой со временем не ликвидируется, а наоборот, усиливается.
Это приводит, в конечном счете, к разрушению прежних симметрии и, как следствие, к возникновению новой структуры. ...