Материалы » Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла » Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Иммунофлюоресцентная микроскопия
Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют AT, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию. ...

За что?
Невольно задаешься вопросом: Отчего такая ненависть у экологиче­ских организаций именно к трансгенным организмам? Первое, что приходит в голову это то, что, борясь с ГМО, экологистам не нужно тратить много сил. Проводишь яркие шумные кампа­нии с пугающими картинками - все видят, телевидение показывает, газеты печатают. Просто, зрелищно ...

Многообразие и единство элементарных частиц. Проблема их классификации.
Сейчас известно примерно 400 элементарных частиц. Не­которые из них «живут» очень короткое время, быстро превращаясь в другие частицы, успевая за время своего существова­ния пролетать расстояния, равные радиусу атомного ядра (10ˉ12— 10ˉ13 см). Минимальное время, доступное экспериментально­му измерению, характеризуется величино ...