BioNow

КПH (КПE, энкефалинконвертаза) впервые выделена и охарактеризована Fricker и Snyder из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [152]. Позднее фермент был выделен и очищен из мозга [34, 153, 154], гипофиза [153, 154], островков Лангерганса поджелудочной железы [122, 133, 161, 198]. Фермент, выделенный из разных тканей разных видов животных, имеет очень близкие физико-химические и каталитические свойства.

КПH является одноцепочечным гликопротеином и существует как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах [34, 122, 197]. Существуют две формы мембраносвязанной КПH, отличающиеся по прочности связывания с мембранами. Одна из этих форм экстрагируется из мембран при pH 5,6 1 M раствором NaCl, вторая – только при совместном воздействии 1 M NaCl и 1% Тритона X-100 [147, 258].

Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000 [209], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [140, 161]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [168, 169], которая превращается в активные формы с Mr 52000 - 53000 и 55000 - 57000 [140, 161, 220]. Отличия в Mr этих форм не связаны с различиями в степени гликозилирования [161, 220, 221]. Форма с Mr 55000 - 57000 отличается от формы с Mr 52000 - 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [220]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [161, 140]. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [143, 147]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [171]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [147]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. В аминокислотной последовательности КПH обнаружен также Ca2+-связывающий участок [213], но ионы Ca2+ влияют не на активность, а на стабильность, агрегацию и способность к связыванию с мембранами [255].

КПН проявляет максимальную активность при рН 5,5-6,0, что соответствует рН внутри секреторных везикул и является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится ион Zn2+ [149, 153]. Данный фермент сильно (примерно в 5-10 раз) активируется ионами Со2+, в меньшей степени (в 2-3 раза) – ионами Ni2+, ингибируется ионами Сd2+ и Cu2+, хелатирующими агентами: ЭДТА, о-фенантролином, при применении которых активность фермента восстанавливается добавлением ионов Zn2+. Фермент также ингибируется реагентами на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимидом и органическими кислотами, содержащими амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Кi 8,8 и 7,5 нМ соответственно.

ФМСФ, 2-меркаптоэтанол, а также ионы Мg2+ и Mn2+ не влияют на активность КПН [149, 152, 153, 167, 258].

КПH отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца синтетических и природных пептидов. Скорость отщепления остатков аргинина в несколько раз больше, чем остатков лизина. Остатки гистидина отщепляются с очень маленькой скоростью, по сравнению с остатками лизина. Остатки ароматических аминокислот не отщепляются. Скорость расщепления субстратов зависит от предшествующего аминокислотного остатка. Скорость расщепления дансил-фен-ала-арг на порядок выше, чем скорость расщепления дансил-фен-гли-арг, дансил-фен-лей-арг и дансил-фен-иле-арг [167, 172, 234, 254].

Локализация фермента в целом соответствует распределению биологически активных пептидов и их предшественников [50, 144, 145]. Наиболее высокая активность КПH обнаружена в аденогипофизе, хромаффинных гранулах надпочечников [152, 153, 154] и островках Лангерганса поджелудочной железы [122, 161]. Более низкая (примерно на порядок) активность фермента обнаруживается в задней доле гипофиза [172, 177], гипоталамусе, стриатуме, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [89]. Наиболее низкая активность КПH обнаружена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках. Установлено, что КПH ассоциирована со структурными элементами ЭПР, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [144]. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины [196], атриальный натрийуретический фактор [197], глюкагон [161, 218], инсулин [122, 133], АКТГ [134, 201], пролактин [150], вещество P [111], вазопрессин и окситоцин [214, 234] и другие регуляторные пептиды. Различные ингибиторы и активаторы секреции координировано регулируют выделение КПH и энкефалинов [151, 170], АКТГ [182, 183, 201], пролактина [150], вазопрессина [103, 200] и инсулина [160].

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на культуры клеток, нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПН свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, b-эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р и др.

Влияние хронического введения галоперидола на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс.
Хроническое введение галоперидола вызывало снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП через сутки после воздействия в гипофизе на 44%, в четверохолмии на 38%, в мозжечке на 39%, в гиппокампе в 5 раз, в больших полушариях в 3,7 раза, в надпочечниках в 2,5 раза относительно контроля (рис. 4). Через трое суток после введения галоперидола ак ...

Методы снятия внешних промеров.
Масса тела измеряется при помощи электронных весов, взвешиванием целой тушки животного. Длина тела измеряется от кончика носа до корня хвоста. Косая длина тела измеряется от крайней передней точки выступа плечевой кости до крайнего заднего выступа седалищного бугра. Высота в холке измеряется от земли до крайней точки холки. Высота крест ...

Показатели жирового обмена в сыворотке крови
Клиническое значение. Определение в крови общих липидов и их отдельных фракций рекомендуется проводить в крови, взятой через 12 час. после еды. В противном случае повышенное содержание липидов (гиперлипидемия) не имеет диагностического значения. При учете сказанного выше гиперлипидемия может указывать на поражение печени и почек, в осо ...