Материалы » Активность основных карбоксипептидаз при действии нейролептиков » Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н

Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н

Активность КП Н определяли модифицированным методом Fricker L.D. и Snyder S.H. [148].

Для определения активности фермента к 150 мкл (в случае опытной пробы) или 140 мкл (в случае контрольной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), добавляли 50 мкл гомогената ткани. В контрольные пробы, кроме того, добавляли 10 мкл 25 мкМ водного раствора ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37°С 210 мкМ дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты.

Для экстракции продукта реакции – дансил-фен-ала – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Характеристика экзо- и эндотоксинов
Экзотоксины - это вещества белковой природы, выделяемые во внешнюю среду живыми патогенными бактериями. Оказывают избирательное повреждающее действие на клетки хозяина. Экзотоксины высокотоксичны, обладают выраженной специфичностью действия и иммуногенностью (в ответ на их введение образуются специфические нейтрализующие антитела). ...

Антропогенные факторы
В современную эпоху деятельность человека оказывает огромное влияние на природные условия всей планеты. Особенно сильно изменены флора и фауна суши. Многие виды животных полностью уничтожены человеком, а еще большее количество видов находится под угрозой их исчезновения. Растительные покровы на большей части поверхности континентов пре ...

Генная инженерия
Генная инженерия возникает в70-е гг. как новая отрасль молекулярной биологии, главная задача которой – активная и целенаправленная перестройка генрв живых существ, их конструирование, то есть управление наследственостью. Генная инженерия – раздел молекулярной генетики, связанный с целеноправленным созданием in vitro новых комбинаций г ...