Материалы » Принципы биохимических исследований » Общие принципы хроматографии, классификация хроматографических методов

Общие принципы хроматографии, классификация хроматографических методов
Страница 1

Всем хроматографическим методам присущи некоторые общие характеристики, позволяющие ниже изложить элементы их обобщенной теории. Однако сначала рассмотрим специфические особенности различных вариантов хроматографического фракционирования. Это, с одной стороны, позволит за теоретическими рассуждениями все время видеть реальные черты хроматографического эксперимента, а с другой - даст возможность ввести классификацию хроматографиче-ских методов. В ходе дальнейшего изложения (в частности, для его разбиения по главам) удобнее всего классифицировать методы по основному принципу фракционирования. Такую классификацию мы рассмотрим достаточно подробно и лишь в конце раздела кратко отметим другие возможные варианты классификации.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПО ПРИНЦИПУ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ.

Как уже упоминалось, в любом хроматографическом процессе фигурируют неподвижная и подвижная фазы, между которыми распределяются молекулы фракционируемой смеси веществ. Под основным принципом фракционирования будем подразумевать природу физического, химического или биологического явления, обусловливающего такое распределение.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПО СПОСОБУ ЭЛЮЦИИ.

Фронтальный анализ.

Так называется вариант хроматографического процесса, когда раствор смеси компонентов непрерывно подается на вход хроматографической колонки. На выходе ее в этом случае появляются один за другим несколько "фронтов" элюата. За первым из них следует чистый, быстрее других мигрирующий в данной системе компонент смеси, отличающийся, очевидно, наименьшим сродством к неподвижной фазе. Второй фронт отмечает добавление к нему следующего по подвижности компонента. За третьим фронтом следует уже смесь трех компонентов. В настоящее время по вполне понятным причинам фронтальный анализ почти вышел из употребления и применяется лишь в отдельных, специальных случаях.

Вытеснительная хроматография.

В этом варианте в колонку или на стартовую линию хроматографической пластинки наносят определенную порцию раствора исходной смеси веществ, а затем ведут элюцию раствором вещества, обладающего заведомо большим сродством к неподвижной фазе хроматографической системы, чем любой из компонентов смеси. Происходит вытеснение их из неподвижной фазы, причем в первую очередь тех, которые обладают меньшим сродством к сорбенту, а затем и всех остальных. Элюент выталкивает все компоненты смеси впереди себя наподобие поршня. Так как они выходят в подвижную фазу концентрированными, то между ними также идет конкуренция за связь с неподвижной фазой. Компоненты, уступающие другим в силе сродства к этой фазе, оттесняются еще вперед, где сорбируются, но только до тех пор, пока их опять не вытеснят компоненты, обладающие большим сродством к сорбенту. В результате такого чередования сорбции и вытеснения компоненты смеси будут выходить из колонки один за другим в порядке возрастания силы их связи с неподвижной фазой. Ясно, что при этом зоны соседних компонентов будут соприкасаться или даже немного перекрываться друг с другом. Для аналитического фракционирования метод непригоден, но хорош для препаративного или полупромышленного разделения веществ, поскольку емкость колонки здесь используется очень эффективно.

Хроматографическая элюция.

В отличие от предыдущего в этом методе элюирующий раствор обладает меньшим сродством к сорбенту, чем любой из компонентов вносимой на колонку или пластинку смеси веществ. Эти компоненты постепенно "вымываются" из неподвижной фазы и движутся вдоль колонки за счет непрерывного перераспределения их молекул между неподвижной фазой и элюентом. Каждый из них мигрирует независимо от других в соответствии с соотношением сил его сродства к неподвижной и подвижной фазам. Миграция идет тем медленнее, чем больше сродство к неподвижной фазе. Именно этот, пригодный для аналитических целей вариант хроматографии подробно рассмотрен в следующем разделе, поэтому здесь можно ограничиться указанием на то, что при хроматографической элюции компоненты смеси выходят из колонки отдельными, разделенными друг от друга зонами, которые в соответствии с типичной формой профиля распределения вещества в каждой такой зоне (см. ниже) часто называют хроматографическими пиками.

Страницы: 1 2


Фотосинтез
До сих пор мы рассматривали организмы, которые для обеспечения конструктивных процессов используют энергию химических связей органических или неорганических веществ. Другая большая группа организмов способна обеспечивать конструктивный метаболизм за счет световой энергии в процессе, который получил название фотосинтез. Итак, фотосинтез ...

Разрушение клеток и экстракция. Центрифугирование
Принцип метода, основные определения и формулы. Центрифугирование применяется для разделения неоднородных жидких сред. Центрифугирование позволяет разделить смесь, состоящую из двух или более компонентов с разной удельной плотностью, если по крайней мере один из этих компонентов - жидкость. Разделение веществ с помощью центрифугирован ...

Серологические методы
Классические серологические реакции применяют для выявления бактериаль­ных AT, а также для выявления Аг, особенно для идентификации бактериальных Аг. Среди современных методов наибольшее распространение нашли методы твердофазного ИФА и ла­текс-агглютинации. ...