Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2мкМ pc1,

· 0,2мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,

· 10мкл растворителя,

· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


Роль углеводов
Углеводы служат основным источником энергии. Свыше 56% энергии организм получает за счет углеводов, остальную часть - за счет белков и жиров. В зависимости от сложности строения, растворимости, быстроты усвоения углеводы пищевых продуктов подразделяются на простые углеводы: моносахариды (глюкоза, фруктоза, галактоза), дисахариды (сахар ...

Отличие живых систем от неживых.
Первые живые существа появились на нашей планете около 3 млрд. лет назад. От этих ранних форм возникло бесчисленное множество видов живых организмов, которые, появившись, процветали в течение более или менее продолжительного времени, а затем вымирали. От ранее существовавших форм произошли и современные организмы, образующие четыре царс ...

Цели и задачи
1. Цели: А) определить влияние нитрата аммония на рост проростков пшеницы; Б) определить устойчивость данного вида растений к определенным концентрациям нитрата аммония. 2. Задачи: А) обработать нитратом аммония разных концентраций семена пшеницы; Б) определить при каких концентрациях будет наблюдаться стимуляция роста данного раст ...