Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2мкМ pc1,

· 0,2мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,

· 10мкл растворителя,

· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


ДНК-микрочипы
Существуют белковые, ДНК, углеводные, тканеые чипы. Особого внимания заслуживают ДНК-чипы. Они представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с по ...

Анатомия и физиология лишайников
Вегетативное тело лишайника – таллом, или слоевище. По внешнему виду различают три типа талломов лишайников: накипные, листовые и кустистые. Слоевище накипного лишайника представляет собой корочку, прочно сросшуюся с субстратом – корой дерева, древесиной, поверхностью камней. Листовые лишайники имеют вид чешуек или пластинок, прикрепле ...

Выводы:
1. Получен и обработан набор дифракционных данных для комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант). 2. Методом молекулярного замещения определена структура комплекса. 3. Показано, что рибосомный белок комплекса S15 связывается с 16S рРНК в двух пространственно удалённых участках. 4. Показано, что мутация Т3С не изменяет пространственной ст ...