Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2мкМ pc1,

· 0,2мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,

· 10мкл растворителя,

· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


Распространение плодов и семян. Понятие диаспоры
В начале XX века шведский ботаник Р.Сернандер дал любым частям растений, с помощью которых они способны расселяться общее название диаспор. В качестве диаспор могут выступать семена, плоды , соплодия , части вегетативного тела и даже целые растения. Существуют два основных пути распространения диаспор. Автохория – наиболее простой спос ...

Результаты исследования. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс в норме и при действии психолептиков. Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных крыс
Данные о распределении активности КП Н, полученные в ходе исследования, представлены в таблице 1. Таблица 1. Активность КП Н у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ± m, n = 7-8) Отделы мозга, органы КП Н M±m Гипофиз 1,36±0,18 Гипоталамус 0,29±0,02 Четверохол ...

Киты, и не только.
Дельфины - это два семейства зубатых китов. Представители семейства океанических дельфинов (или просто дельфиновых) всем известны, но кроме них есть еще и семейство пресноводных дельфинов. Четыре вида этого семейства водятся в реках и озерах Азии и Южной Америки. Пресноводные или речные дельфины - самые примитивные представители отряда ...