Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)
Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.
Постановка ПЦР:
· 7 нг матрицы,
· 0,2мкМ pc1,
· 0,2мкМ pc2,
· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,
· 10мкл растворителя,
· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).
Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):
|
94о С 120 сек |
1 цикл |
|
94о 20 сек |
30 циклов |
|
60о 20 сек | |
|
72 о С 40 сек | |
|
и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек | |
Деление клетки. Митоз
Процесс деления у эукариот можно разделить на две стадии: митоз и цитокинез.
Митоз (от греч. «митос» – нить) – это образование из одного ядра двух дочерних ядер, морфологически и генетически эквивалентных друг другу. Цитокинез включает деление цитоплазматической части клетки с образованием дочерних клеток.
Биологическая роль митоза со ...
Значение, источники, роль углеводов. Понятие и сущность углеводов
Углеводы как эссенциальные компоненты пищевого рациона не только определяют основной энергетический гомеостат организма, но существенно необходимы также для биосинтеза многих углеродсодержащих полимеров. На протяжении жизни человек в среднем потребляет около 14 тонн углеводов, и том числе более 2,5 тонн простых углеводов. Углеводы являю ...
Взаимосвязь природы и общества
Элементарной структурной единицей биосферного уровня организации жизни на Земле является биогеоценоз. Биогеоценоз – это участок земной поверхности (вместе с почвой, водными компонентами среды и прилежащей атмосферой), занимаемый биоценозом, - совокупность растений, животных, грибов и микроорганизмов, связанных между собой и образующих « ...