Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)
Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.
Постановка ПЦР:
· 7 нг матрицы,
· 0,2мкМ pc1,
· 0,2мкМ pc2,
· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,
· 10мкл растворителя,
· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).
Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):
|
94о С 120 сек |
1 цикл |
|
94о 20 сек |
30 циклов |
|
60о 20 сек | |
|
72 о С 40 сек | |
|
и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек | |
Время
культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 1)
4сутки
(вариант 2)
4, 6 сутки
(вариант 3)
ЭДТА,
г/л
Биомасса,
г/л
ЭДТА,
г/л
Биомасса,
г/л
ЭДТА,
г/л
Биомасса,
г/л
0
0,94
0,010
0,94
0,010
0,94
0,010
1
0,78
0,016
0,78
0 ...
Мускулатура
Состоит из однородных сегментов, разделенных соединительно-тканными перегородками. Дифференцировка мышц находится на начальном этапе становления и коснулась только мышц, управляющих движениями глаз, жабр и челюстей. В отличие от рыб, в большей своей части утратила сегментированное строение. Произошла дифференцировка на отдельные лентови ...
Болезни почек
Сложное и четкое функционирование почек может быть нарушено воздействием препаратов или болезнями. Кофеин (находящееся в час и кофе химическое вещество) угнетает процессы высвобождения АДГ гипофизом. Это означает, что с мочой будет выделяться больше воды. Аномальное увеличение объема мочевыделения называется диурезом, а вызывающие его в ...