Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)

Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.

Постановка ПЦР:

· 7 нг матрицы,

· 0,2мкМ pc1,

· 0,2мкМ pc2,

· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,

· 10мкл растворителя,

· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).

Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):

94о С 120 сек

1 цикл

94о 20 сек

30 циклов

60о 20 сек

72 о С 40 сек

и по окончании нужного количества циклов

72 о С 120 сек


Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс в норме и при введении психолептиков. Распределение активности карбоксипептидазы М в тканях интактных животных
Данные о распределении активности КП М в тканях самцов крыс представлены в таблице 9. Таблица 9. Активность КП М у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ± m, n = 7-8) Отделы мозга, органы КП М M±m Гипоталамус 0,08±0,005 Четверохолмие 0,11±0,007 Мозжечок 0, ...

Проводящие ткани и их функции. Стелярная теория
Стелярная теория, учение о принципах строения и взаимоотношениях между типами стелы (центрального цилиндра) у высших растений. Большую часть стелы составляют проводящие ткани: ксилема (древесина) и флоэма (луб), по-разному расположенные в разных типах стелы. Проводящие ткани обычно окружены перициклом, состоящим из механических и паренхи ...

Виды ржавчины на овсе
Линейная (стеблевая) ржавчина. Возбудитель— Puccinia graminis Pers. f. avenae Eriks. et Henn. Проявляется так же, как и на других злаках. Корончатая ржавчина. Возбудитель — Puccinia согоnifera Kleb. f. avenae Eriks. et Henn. Поражает листовые влагалища, на которых развивается сначала летняя стадия гриба в виде желтых порошащих подушече ...