Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)
Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н.
Постановка ПЦР:
· 7 нг матрицы,
· 0,2мкМ pc1,
· 0,2мкМ pc2,
· деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл,
· 10мкл растворителя,
· 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз).
Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл):
|
94о С 120 сек |
1 цикл |
|
94о 20 сек |
30 циклов |
|
60о 20 сек | |
|
72 о С 40 сек | |
|
и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек | |
Основная часть. Описание опыта
Материалы и оборудование: проростки пшеницы, выращенные на средах с добавлением нитрата аммония разных концентраций.
Реактивы: нитрат аммония.
Выполнение работы.
Приготовили растворы нитрата аммония 1% и 10%. Семена пшеницы (по 10 штук) поместили в фильтровальную бумагу, один конец которой опустили в химические стаканы с приготовленн ...
Ластоногие
Величественно море с его огромным и богатым подводным миром живых существ. В его разнообразии изначально царит дивный и строгий порядок.
Учёные, занимающиеся классификацией животных, разделили ластоногих на три семейства: ушастые тюлени, настоящие тюлени и моржи.
Пища и охота. Тюлени питаются рыбой. Большие глаза помогают им хорошо ви ...
Определение биотехнологии
Общепризнано, что содержанием биотехнологии является использование достижений фундаментальных биологических наук в практических целях. Четверть века назад Европейская федерация по биотехнологии выдвинула следующий тезис: «Биотехнология — применение биологических систем и процессов в промышленности и сфере услуг», не подчеркнув научное с ...