Материалы » Искусственный синтез олигонуклеотидов » Воспроизведение «значащей» части гена по известной иРНК

Воспроизведение «значащей» части гена по известной иРНК

Предположим, что мы располагаем достаточным количеством нашей индивидуальной иРНК. Рассмотрим последовательность операций, позволяющую произвести метаморфозу этой иРНК в соответствующую ей часть гена прямо в пробирке.

Нам известно, что иРНК животного происхождения на своем 3'-конце несет длинный «хвост» адениновых нуклеотидов (поли А).

1 этап. Добавим к раствору нашей иРНК в достаточном количестве олигонуклеотид длиной в десяток-другой дезоксириботи-мидинов (олиго дТ). Мы уже знаем, как его можно синтезировать. Олиго дТ может гибридизоваться с поли А. Создадим для этого оптимальные условия (буфер, концентрация соли, умеренно повышенная температура). Мы получим структуру, с которой начнется 2-й этап.

2 этап. Добавим в раствор нам еще не встречавшийся фермент — «обратную транскриптазу». В присутствии 4-х дезоксирибонуклеотидов этот фермент способен вести комплементарный синтез ДНК по матрице РНК в нормальном направлении от 3' к 5'-концу матрицы. Он тоже нуждается в праймере, каковым для него послужит уже сидящий на 3'-конце иРНК олиго дТ

3 этап. Обработаем полученный РНК-ДНК гибрид упомянутой ранее рибонуклеазой Н. Она как раз разрушает РНК, находящуюся в двунитевом гибридном комплексе с ДНК (см. там же). Однако поставим этот фермент в такие условия, чтобы наша иРНК была разрушена не до конца — остались небольшие ее участки.

4 этап. От этих участков, как от праймеров, начнет работать вносимая на этом этапе ДНК-полимераза I. Она, как нам известно, не только ведет матричный синтез ДНК, но и обладает S'-S* экзо-нуклеазной активностью. Благодаря этому она разрушает остатки иРНК и образует из синтезированных ею фрагментов, не без помощи все той же ДНК-лигазы, полноценную нить ДНК.

Полученную таким образом двухнитевую молекулу принято именовать «кДНК», имея в виду, что она является комплементарно выстроенным отображением исходной иРНК. Эта ДНК соответствует значащей последовательности нашего гена, поскольку все интроны (повторю это еще раз) были «вырезаны» уже при выходе исходной иРНК из ядра в цитоплазму. РНК-полимераза бактерии, которой придется транскрибировать плазмидную ДНК, на участке этой встроенной кДНК произведет полноценную иРНК для синтеза интересующего нас белка.


Основная часть
Эпоха нового времени охватывает 3 столетия-XVII, XVIII, XIXвв. С XVII века начинается эпоха Нового времени. В этом трехсотлетнем периоде особую роль сыграл XVII век, ознаменовавшийся рождением современной науки, у истоков которой стояли такие выдающиеся ученые как Галилей, Кеплер, Декарт, Ньютон. В XVII веке укрепился капиталистический ...

Периодическое культивирование с подпиткой (fed batch culture)
Термин «периодическая культура с добавлением источников питания» ввели Иошида и др. для обозначения периодической культуры, в которую непрерывно добавляется питательная cреда [25]. Простое периодическое культивирование характеризуется ростом клеток без подачи дополнительных порций субстрата после посева культуры. Лимит субстрата или об ...

Метод определения парциального давления углекислого газа в капиллярной крови пловцов
Парциальное давление углекислого газа в крови определяли с помощью потенциометрических микроэлектродов [26]. ...