BioNow

Является стандартно используемой методикой для определения РНК-белковых взаимодействий и оценки константы связывания. Принцип данного метода основан на способности нитроцеллюлозных фильтров удерживать белки, а также связанные РНК, пока несвязанные РНК проходят через фильтр. Несмотря на свою концептуальную простоту, метод всё же не является достаточно надёжным и не подходит для изучения некоторых РНК-белковых комплексов: он хорошо работает для сравнительно небольших молекул РНК, большие же молекулы РНК-белковых комплексов часто не удерживаются.

Методика заключается в том, что эквимолярные количества радиоактивной РНК смешиваются с белком в различной концентрации и фильтруются через нитроцеллюлозные фильтры. В идеале при высокой концентрации белка должно удерживаться до 100% РНК, в действительности же этот процент значительно меньше. Кроме того, белковые фракции также могут не удерживаться фильтром. Например, при анализе взаимодействия белка L18 с 5S рРНК было обнаружено, что эффективность связывания комплекса 5SрРНК-L18 составляла 35% при удержании 65% белка L18, и < 5% для свободной 5S рРНК. Тем не менее, точность измерения не зависит непосредственно от эффективности задерживания.

На оценку эффективности связывания влияют многие параметры, и они должны быть оптимизированы для каждого конкретного случая:

Буфер

: Повышение концентрации солей уменьшает эффективность связывания. Для большинства комплексов концентрация одновалентных ионов должна составлять около 150 mM, чтобы гарантировать специфичность связываться.

Температура

: Низкая температура увеличивает эффективность связывания.

Скорость подачи буфера и условия промывки

: скорость подачи буфера должна быть постоянной (одной и той же) в каждом эксперименте. Неспецифическое удержание несвязанного РНК на фильтре можно уменьшать интенсивной промывкой, но зачастую это ведёт и к снижению специфической сорбции в целом. Поэтому для некоторых комплексов применяется промывка небольшим объёмом, в то время как для других комплексов наилучшие результаты получаются при промывке большими объёмами.

Ренатурация РНК

: хорошо известно, что разные препараты РНК дают различную эффективность связывания. Тщательная ренатурация уменьшает вариабельность между этими препаратами [23].

Гендерный поворот в культурологическом знании
В современном социально-гуманитарном знании произошёл целый ряд таких познавательных "поворотов", как социоисторический, антропологический, гендерный, лингвистический, визуальный, когнитивный. Понятие познавательный "поворот" обозначает качественные изменения в системах производства знания и его передачи. "В сод ...

Обзор проблемы контроля и сохранения биологического разнообразия биосферы
К первым документам, поставившим на научную основу проблему БР, относится Всемирная Стратегия Охраны Природы (1980-1991) (1991), сформулировавшей стратегические цели и задачи сохранения БР и генресурсов. После первой по значимости цели – сохранения жизнеобеспечивающих систем (воздуха, вод, лесов и почв) было поставлено сохранение БР и г ...

Строение ядра
Ядро – обязательная и существенная часть живой клетки всех эукариотических организмов. Ядро растительной клетки открыл Роберт Броун. Классические труды по выяснению роли ядра в жизни клетки принадлежат русскому ботанику Герасимову (1890-1905). Ядро контролирует жизнедеятельность клетки, сохраняет генетическую информацию и передает ее до ...