Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации
ПЦР ставили по протоколам с использованием SYBRgreen и TaqMan. Амплификация проходила в микропланшетах в объеме смеси – 1 мкл (на геле эти образцы обозначены прописной буквой «ч») и как контроль в амплификаторе «ТерЦик» под минеральным маслом в объеме 20 мкл(на геле – это образцы с индексом «а»). Заглавные буквы T и S означают ПЦР с системой TaqMan и SYBRgreen соответственно. Индексы 1, 2 и 3 в системе TaqMan означают использование разных растворов полимераз и в принципе важного значения для этого опыта не имеют, поэтому их можно расценивать как 3 повтора. Индекс «чдо» у одного из S означает ПЦР-смесь до амплификации. В карман геля наносили по 5 мкл образца. М – маркер – смесь нуклеиновых кислот размером от 50 до 1000 п.н.
На рис. видно, что амплификация прошла во всех пробах системы TaqMan. Шесть полос, проявившихся на геле чуть ниже уровня полосы маркера с цифрой 100 означают, что во всех этих пробах прошла реакция и наработался фрагмент ДНК размером около 100 п.н. На дорожках, куда вносили пробы после амплификации в «Терцике» полосы проявились сильнее, чем на дорожках с пробами из чипа. Значит наработанного фрагмента в плашках меньше, чем в макрообъеме под маслом. Это обстоятельство опять же объясняется форматом микрообъемов, где погрешности каждого из этапов работы становится критичным. В случае с SYBRgreen также наблюдается подобная картина. Полоски не проявились в случае с образцом не прошедшим амплификацию и проявились на дорожках лунок, куда вносили образцы после амплификации. Следовательно амплификация в них прошла и наработался фрагмент размером около 600 п.н.
Гель фотографировали с зеленым светофильтром, пропускающим соответствующую длину волны красителя (520 нм). На геле хорошо заметны зеленые полосы крашенной наработанной в процессе амплификации ДНК и исходной матрицы(полосы в самом начале карманов), которая имеет большой размер (5000 п.н.) и за время разделения успела только войти в гель. Опять же количество наработанного фрагмента в чипе меньше (хоть и не значительно по сравнению с системой TaqMan), чем в макрообъемной ПЦР-смеси. Однако нужно обратить внимание на то, что верхняя полоса в лунке S18ч окрашена слабее, чем в лунке S18а. Это говорит о том, что изначально количество матрицы в образце было меньше, что опять же связано с погрешностями в работе с микрообъемами.
RealTime ПЦР
Принцип метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэри Мюллисом в 1983 г. Первые сообщения по практическому применению метода появились в 1985 г.[18] С тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест наряду с работами, в которых применяются автоматическо ...
Гипофиз
Гипофиз (hypophysis cerebri) имеет массу 0,5 — 0,6 г, находится в гипофизарной ямке турецкого седла клиновидной кости и отделен от полости черепа отростком твердой оболочки головного мозга, образующим диафрагму седла. Через отверстие в этой диафрагме гипофиз соединен с воронкой гипоталамуса промежуточного мозга. Поперечный размер гипофи ...
Лаборатории разных групп риска
В зависимости от уровня безопасности работы с микроорганизмами лаборатории подразделяют на четыре группы риска.
Первая группа риска: лаборатории особого режима (максимально изолированные) с высоким индивидуальным и общественным риском.
Вторая группа риска: режимные лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным и низким обществ ...